Mejoramiento del medio de cultivo para producción de la lacasa recombinante POXA 1B de Pleurotus ostreatus en Pichia pastoris
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Datum
2016Autoren
Albarracín Pardo, Diego ArmandoDirektor
Poutou Piñales, Raúl AlbertoHerausgeber
Pontificia Universidad Javeriana
Fakultät
Facultad de Ciencias
Programm
Maestría en Ciencias Biológicas
Erhaltener Titel
Magíster en Ciencias Biológicas
Typ
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Maestría
COAR
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Citación
Metadata
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Zusammenfassung
Las lacasas son un tipo de enzimas responsables de procesos de óxido-reducción sobre sustratos de naturaleza aromática. La obtención de estas enzimas a gran escala generalmente no es adecuada cuando se piensa en la secreción por fuentes nativas, por lo tanto, una alternativa es la expresión heteróloga para obtener rendimientos altos y producción de enzimas en mayor concentración. En un proyecto anterior, el grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI), logró la expresión de la lacasa recombinante POXA IB de Pleurotos ostreatos en Ptchia pastoris bajo el control del promotor de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (pGAP). Con el propósito de aumentar la actividad y la producción de esta enzima, en este trabajo se emprendió el mejoramiento de las condiciones del medio de cultivo mediante diseños estadísticos secuenciales, utilizando un diseño factorial de tipo Plackett-Bur/nan (DEPB) seguido de un diseño experimental One Factor (DEOF) con la consecuente comprobación del resultado final. Se estudió la estabilidad de la enzima a diferentes pHs y temperaturas y como variable respuesta o independiente se seleccionó la actividad enzimática (UL;1). Después del DEOF que permitió mejorar la concentración de extracto de levadura, se logró aumentar la actividad enzimática de 451 ± 6.46 UL;1 obtenida en el trabajo previo a 1343.52 ± 40.3 UL;1, lo que significó un incremento de aproximadamente 2.98 veces la actividad enzimática. Al determinar la estabilidad del sobrenadante concentrado se encontró que se retiene más del 90% de la actividad residual a 50°C y ~50% de la actividad residual a 70°C y que se retuvo el 60% de la actividad residual a pH 10 y el pH óptimo fue de 4, reteniendo más del 90% de la actividad enzimática residual.
Abstrakt
The laccases are a type of enzyme responsible for die oxide reduction process on substrates of aromatic nature. The obtention of dns enzymes in a large scale it is not generally adequate when is through secretion in native sources, dierefore an alternative is die heterologous expression, this allows a greater level of production of die enzymes in higher concentration. In a previous project, die Biotechnological Environmental and Industrial Group (GBAI in Spanish) achieved the production of die recombinant Laccase POXA1B from Pleurotus ostreatus in Ptchia pastoris under control from die promoter of die Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (pGAP). With die purpose to mcrease activity and higher production of dns enzyme, this work was undertaken die improvement of die conditions of the cultivation media by sequential statistical designs, using a factorial design type Plackett Burman (PBED) followed by an One Factor Experimental Design (OFED) with die subsequent proof process of die final result. It was studied enzyme stability at a diferents pHs and temperatures using as a variable independent answer die enzymatic activity (UL;1). After the OFED, winch unproved die concentration of yeast extract, we were able to increase die enzymatic activity from 451 ± 6.46 UL'1 previously obtamed at 1343.52 ± 40.3 UL'1, which meant an increase of approxunately 2.98 times die enzymatic activity. Li determining stability of concentrated supernatant under die different conditions assayed, it was found to be retained more than 90% of the residual activity at 50°C and ~50% of the residual activity at 70°C. At pH 10, die concentrated supernatant retained 60% of die residual activity and die optimal pH was 4, retaining more than 90% of the residual enzymatic activity.
Schlüsselwörter
Diseño experimental Plackett-BurmanDiseño one factor
Pichia pastoris
Lacasa recombinante
Estabilidad enzimática mejoramiento
Keywords
Plackett-Burman designOne factor design
Pichia pastoris
Recombinant laccase
Enzyme stability improvement
Themen
Maestría en ciencias biológicas - Tesis y disertaciones académicasEnzimas
Diseño experimental
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