Doctorado en Ciencias Biológicas

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http://hdl.handle.net/10554/331

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Reconstrucción de los cambios en la productividad y la acumulación de carbono en un lago amazónico de la cuenca media durante los últimos 200 años CE
(Pontificia Universidad Javeriana) Palma Silva, Liliana; Rivera Rondón, Carlos Alberto; García Rodríguez, Felipe; Medina Esquivel, Martín; Pinilla, Gabriel Antonio; Campello Cordeiro, Renato; Ferreira Gomes, Doriedson; Sáez, Alberto
A pesar de la importancia de las llanuras aluviales amazónicas en el balance de carbono de los humedales tropicales, solo recientemente se ha comenzado a prestar atención a la importancia real de estos sistemas en el almacenamiento global de carbono. Por otro lado, la hidrodinámica del río Amazonas relacionado con la conectividad hidrológica también influye en el comportamiento, de acumulación de la materia orgánica, acumulación de carbono, productividad primaria, proceso de sedimentación entre otros en lagos de llanura aluvial, como es el caso del sistema lagunar Yahuarcaca. Este trabajo tiene como objetivo: Evaluar los cambios recientes (últimos 200 años) en la acumulación de materia orgánica, carbono y productividad en el lago Yahuarcaca (cuenca media del río Amazonas), mediante un estudio de trazadores múltiples (multiproxy). Para tal fin se estudiaron diferentes proxies (Susceptibilidad magnética, análisis granulométrico de alta resolución, porcentaje de pérdida por ignición, derivados de clorofila, isótopos estables de δ13C y δ15N, tasa de acumulación de carbono, tasa de acumulación de valvas de diatomeas, tasa de acumulación de derivados de clorofila, fluorescencia de rayos X e índices de productividad) de sedimentos en tres lagos del sistema lagunar Yahuarcaca con diferentes grados de conexión con el río Amazonas: Lago Largo (YAH-1), Anaconda (YAH-2) y Pozo Hondo 1 (YAH-4). Los núcleos fueron datados con 210Pb y 137Cs. Los resultados indicaron dos etapas paleolimnológicas; una transición límite establecida en 1980-1984 EC, atribuida al cierre geomorfológico y la separación completa de Yahuarcaca con el río Amazonas y el inicio de condiciones lénticas completas. El pulso de inundación y la conexión con el río Amazonas definieron la magnitud de los aportes orgánicos, donde el lago más cercano y conectado al río (YAH-1) estuvo fuertemente relacionado con su variabilidad hidrológica interanual a través del canal de entrada, y el lago más distante/aislado del río (YAH-4) mostró una mayor acumulación de carbono de producción autóctona debido a la conexión más débil con el río mismo y las condiciones lénticas más estables para la sedimentación. Considerando los resultados del análisis de diatomeas, Yahuarcaca presentó una alta riqueza de diatomeas dada especialmente por los morfotipos del género Pinnularia y una baja abundancia, sin embargo, el género más dominante en la abundancia fue Aulacoseira donde los mayores valores de esta estuvieron en YAH-4. En cuanto a los proxies de productividad, la concentración de valvas, la tasa de acumulación de clorofila, la tasa de acumulación de carbono y la relación C/N indican que el principal aporte de materia orgánica fue algal, siendo las diatomeas en este tipo de sistemas buenas indicadoras de la productividad. Entre núcleos, los mayores valores estuvieron en YAH-4 por ser un lago más estable históricamente, esto también puede estar explicado por las grandes capas de macrófitas, que a su vez aportan una cantidad significativa de diatomeas y materia orgánica al lago. Los cambios en la productividad del sistema lagunar pueden explicarse por la dinámica, conexión e influencia del río Amazonas a lo largo de 200 años de historia.
Evaluación de la actividad antifúngica de péptidos sintéticos derivados de Lactoferricina Bovina solos o en combinación con extractos de Bidens pilosa : un acercamiento al mecanismo de acción
(Pontificia Universidad Javeriana) Vargas Casanova, Yerly; Parra Giraldo, Claudia Marcela; Modesti Costa, Geison; García Castañeda, Javier Eduardo; Alonso Monge, Rebeca; Muñoz, Julián Esteban; Jiménez, María del Pilar; Celis, Adriana; Arévalo Pinzón, Gabriela
Péptidos antimicrobianos (PAMs) y metabolitos de extractos vegetales son productos naturales (PNs) generados por los organismos para su defensa frente a los patógenos. Péptidos cortos derivados de Lactoferricina Bovina (LfcinB) y extractos de la planta Bidens pilosa, han presentado actividad contra diferentes microorganismos, entre ellos, Candida spp. Esto es relevante para el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades causadas por Candida spp., que se han incrementado debido al aumento de la población nmunocomprometida, escasez de antifúngicos, toxicidad y resistencia. Según lo anterior, péptidos de LfcinB y extractos de B. pilosa, pueden ser potencialmente activos para el ratamiento de infecciones ocasionadas por estas levaduras; sin embargo, el empleo de PNs en el ámbito terapéutico ha sido un reto debido a inconvenientes como: estabilidad, citotoxicidad y altos costos; para solventar estas limitaciones y potenciar la actividad, se han utilizado estrategias como, modificar químicamente los PNs y explorar el uso de terapias combinadas. En el presente trabajo se evaluó la actividad antifúngica, posible mecanismo de acción y efecto citotóxico de péptidos sintéticos derivados de LfcinB y/o extractos de B. pilosa. Para esto el trabajo se desarrolló en tres etapas: Etapa I: tamizaje de actividad antifúngica del péptido R-1-R: RWQWRWQWR, 20 péptidos análogos y 3 extractos de B. pilosa contra C. albicans SC5314 y 256, y C. auris 435 y 537. Los resultados muestran que el péptido R-1-R y un extracto etanólico de hojas de B. pilosa, presentaron la mayor actividad antifúngica, con Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs) entre 100 y 200 μg/mL para el péptido y 500 μg/mL para el extracto. Además, se observó un efecto fungistático y fungicida dependiente de la concentración en ambos casos. En la Etapa II: El péptido R-1-R y el extracto etanólico de B. pilosa fueron evaluados en combinaciones entre sí o con fluconazol (FLC); la mejor actividad se observó cuando se combinó el péptido y el extracto, obteniendo . efecto sinérgico en la actividad contra C. albicans SC5314, C. auris 435 y C. auris 537 y efecto aditivo contra y C. albicans 256 En la Etapa III, se estableció que la actividad antifúngica del péptido R-1-R, el extracto de B. pilosa y la combinación de estos contra cepas de C. albicans, sensible y resistente a FLC, puede estar asociada a afectación de la superficie celular, transportadores de membrana, cadena respiratoria y polarización de membrana mitocondrial, que sugieren muerte celular por apoptosis, lo que fue respaldado por, microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM), al observar la presencia de microcuerpos citoplasmáticos. Mediante STEM, también se observó citoplasmas desorganizados después de la incubación con péptido, extracto y combinación, lo que ha sido correlacionado con muerte celular por necrosis. Los resultados de microscopía variaron acorde a la especie y las concentraciones de los tratamientos usadas. El efecto hemolítico del péptido, el extracto y su combinación, fue dependiente de la concentración y se observó baja citotoxicidad en eritrocitos y fibroblastos. Finalmente, en el modelo in vivo de Galleria mellonella, al igual que en el modelo in vitro, la toxicidad disminuyó cuando el péptido y el extracto fueron combinados y además se observó dependencia con la forma de administración de los tratamientos. Los resultados sugieren que la combinación del péptido R-1-R y el extracto etanólico de hojas de B. pilosa, es una estrategia eficaz para potenciar la actividad antifúngica contra C. albicans y C. auris sensibles y resistentes a antifúngicos. Además, la combinación péptido- extracto fue menos tóxica en eritrocitos, fibroblastos humanos y G. mellonella, que el péptido o el extracto solos. De manera preliminar se estudió el modo de acción del péptido R-1-R, extracto y su combinación, utilizando diferentes técnicas. Los resultados indican que la combinación de PNs y agentes antifúngicos comerciales puede ser considera una alternativa terapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades causadas por Candida spp.
Evaluación del efecto de los fitomedicamentos derivados de Caesalpinia spinosa y Petiveria alliacea en el metabolismo energético en diferentes modelos celulares
(Pontificia Universidad Javeriana) Arévalo Olaya, Cindy Mayerly; Fiorentino Gomez, Susana; Quijano Gomez, Sandra Milena; Morales Alvarez, Ludis del Rosario; López Casillas, Marcos; Martínez Cordero, Humberto; Samudio, Ismael; Gómez Grosso, Luis Alberto
La reprogramación metabólica es un sello distintivo del cáncer, caracterizada por una preferencia por el uso de glucosa y un incremento en las vías anabólicas, entre otras particularidades, que otorgan a las células cancerosas una capacidad superior para proliferar rápidamente, migrar, evadir la apoptosis y resistir a los fármacos. El metabolismo tumoral está influenciado por una variedad de factores, tanto intrínsecos, como la variabilidad genética, como extrínsecos, asociados al microambiente. Esta influencia da lugar al desarrollo de una diversidad de fenotipos metabólicos dentro de un mismo tumor, lo que contribuye a la heterogeneidad intratumoral. Además, estas variaciones metabólicas están condicionadas por el tipo de tejido en el que se origina el cáncer, resultando en patrones metabólicos específicos y adaptativos, que a su vez generan vulnerabilidades inherentes hacia la dependencia de ciertas vías metabólicas. Un ejemplo particularmente interesante son las leucemias agudas, que presentan una adaptación distintiva en su actividad mitocondrial, diferenciándolas de otros tipos de tumores. Entonces, es razonable suponer que las necesidades metabólicas específicas de las células tumorales pueden ofrecer una serie de blancos terapéuticos y biomarcadores para uso clínico. En este contexto, los fitomedicamentos, derivados de productos naturales, han emergido como terapias coadyuvantes prometedoras, ya que pueden modular el metabolismo tumoral y ejercer otras funciones que resultan perjudiciales para las células. Nuestros antecedentes como grupo de investigación destacan el potencial antitumoral del fitomedicamento P2Et, obtenido de Caesalpinia spinosa, así como del extracto SC y el fitomedicamento Esperanza derivados de Petiveria alliacea, en modelos de cáncer de seno, melanoma y leucemia. Estos compuestos presentan mecanismos de acción distintos relacionados con la modulación del metabolismo tumoral, el P2Et aumenta el calcio intracelular y el estrés del retículo endoplásmico, además de ejercer un efecto antioxidante en la mayoría de los modelos celulares evaluados, a diferencia del SC, que induce muerte celular a través de la regulación negativa del metabolismo glucolítico y afecta la subunidad V de la cadena respiratoria mitocondrial. A pesar de haber evidenciado su impacto en el metabolismo, aún no comprendemos en profundidad cómo estos fitomedicamentos regulan el metabolismo energético, el estado redox o la actividad mitocondrial. También, la influencia de la heterogeneidad metabólica según el subtipo de tumor en la respuesta a estos tratamientos sigue siendo un aspecto poco explorado, así como su efecto en combinación con fármacos convencionales. Entonces, en este trabajo nos propusimos, de forma general, establecer el papel de los fitomedicamentos derivados de Caesalpinia spinosa y Petiveria alliacea en la regulación del metabolismo energético en diferentes modelos celulares y evaluar su potencial uso en la modulación de las alteraciones metabólicas de pacientes con cáncer. Inicialmente, nos centramos en el modelo leucémico, incluyendo tanto líneas celulares como células primarias derivadas de pacientes con leucemia aguda. Evaluamos el P2Et, el SC y el Esperanza como tratamientos citotóxicos y antiproliferativos, y también exploramos el efecto de combinarlos con quimioterapéuticos de uso común. Nuestros resultados revelaron que tanto el P2Et como el SC reducen la viabilidad y proliferación de células linfoides y mieloides, mientras que Esperanza disminuye la proliferación de la línea celular mieloide K562. Nuestros resultados revelaron que tanto el P2Et como el SC reducen la viabilidad y proliferación de células linfoides y mieloides, mientras que Esperanza disminuye la proliferación de la línea celular mieloide K562. No obstante, todas las células leucémicas parecen ser más susceptibles al efecto del SC. Además, nuestros hallazgos demostraron que la combinación de P2Et con doxorrubicina, un agente alquilante, tiene efectos antagónicos en células linfoides. En contraste, la combinación de SC o Esperanza con citarabina, un análogo del nucleósido pirimidina, potencia la actividad antitumoral de la droga. En segundo lugar, nos enfocamos en explorar los mecanismos de acción de los fitomedicamentos en relación con la regulación metabólica, incluyendo el consumo de glucosa, el estado de oxidación intracelular y la función mitocondrial. Además de profundizar en el modelo leucémico, incorporamos dos modelos tumorales adicionales: cáncer de seno y melanoma. Dado que nuestro enfoque se centra en el metabolismo, también consideramos relevante incluir un modelo de infección viral, ya que los virus pueden alterar el metabolismo celular de manera similar a las células tumorales, afectando las mismas vías metabólicas. Encontramos que el extracto SC modifica el consumo de glucosa en células tumorales de modelos de cáncer sólido, pero no en leucemias. Por otro lado, el P2Et actúa como un reductor de la oxidación intracelular en todos los modelos tumorales y en el modelo de infección viral, mientras que el SC muestra un rol dual. De manera destacada, demostramos que el P2Et induce una lesión mitocondrial que puede ser reversible, a diferencia del SC y Esperanza, que pueden causar una lesión mitocondrial grave en células leucémicas mieloides, proponiendo a productos naturales derivados de P. alliacea como potenciales mitocans. Asimismo, observamos una selectividad tumoral, con mínimas alteraciones en las células normales por parte del P2Et y Esperanza. Finalmente, con vistas a la aplicación de fitomedicamentos en la medicina traslacional y su evaluación en futuros ensayos clínicos, establecimos un perfil metabólico en pacientes con leucemia aguda. Este perfil servirá como base para identificar cómo los fitomedicamentos alteran las rutas metabólicas alteradas cuando se combinan con quimioterapia. Nuestros hallazgos revelaron que en pacientes con leucemia aguda, el metabolismo de glicerofosfolípidos, esfingolípidos y aminoácidos como la glutamina y la alanina está alterado. Además, observamos que algunas fosfatidilcolinas se asocian con parámetros de buen pronóstico, mientras que el aumento de ciertos ácidos biliares está relacionado con un mal pronóstico. Nuestros hallazgos destacan que las células leucémicas responden más eficazmente al extracto SC en comparación con el P2Et, y que los productos de P. alliacea modifican el efecto de la citarabina hacia una mayor citotoxicidad. Asimismo, que las variaciones metabólicas entre diferentes tipos de cáncer y la capacidad de los fitomedicamentos para alterar rutas metabólicas específicas subrayan su potencial para mejorar las terapias actuales. Además, el daño mitocondrial inducido por P. alliacea y las alteraciones en lípidos específicos podrían ofrecer nuevas oportunidades para la identificación de biomarcadores y blancos terapéuticos en el tratamiento de la leucemia.
Metabolomic study of the chemical composition of bamboos from the genus Guadua (Poaceae) and exploration of their biological potential
(Pontificia Universidad Javeriana) Chitiva Chitiva, Luis Carlos; Modesti Costa, Geison; Castro Gamboa, Ian; Prieto Rodríguez, Juliet Angélica; Peporine Lopes, Norberto; Zuluaga, Martha; Muñoz, Diego Ricardo; Iglesias, José Alfredo; Cesar Pilon, Alan
Los bambúes pertenecientes al género Guadua son reconocidos a nivel mundial por sus diversas aplicaciones en los ámbitos ecológico, social, económico, cultural y medicinal. Sin embargo, hasta la fecha aún se desconoce información sobre su composición química y actividad biológica. En este contexto, el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar la composición química y actividad biológica de bambúes del género Guadua mediante un enfoque metabolómico, con cuatro objetivos principales: (1) evaluar las variaciones en la composición química bajo la influencia de un gradiente altitudinal y mapear la diversidad química mediante GNPS; (2) correlacionar la composición química y actividades biológicas para la identificación de compuestos bioactivos; (3) evaluar las alteraciones metabólicas en las células HCT-116 tras la exposición al extracto de G. incana; y (4) aislar algunos compuestos bioactivos a partir del extracto activo de G. incana, guiado por el enfoque metabolómico. Los resultados obtenidos resaltan que en el primer objetivo se destaca un aumento significativo en la composición de flavonoides a altitudes elevadas. También se demostró una gran riqueza en la diversidad química de estos bambúes. En el segundo objetivo, se identificó la presencia de 49 compuestos en las especies de Guadua, incluyendo flavonoides y derivados de ácidos cinámicos que mostraron una fuerte correlación con las actividades antiinflamatoria y antioxidante. Particularmente, se encontró que flavonas glucosiladas presentaron una correlación positiva con el potencial citotóxico. En el tercer objetivo, se encontraron una alteración de 99 metabolitos en las células HCT-116 cuando fueron tratadas con el extracto activo de G. incana, asociados principalmente con el metabolismo del glutatión. Finalmente, en el cuarto objetivo se aisló una flavona glucosilada correspondiente a isoschaftosido que mostró una potente actividad citotóxica y una mezcla de tres flavonas derivadas de apigenina. En conclusión, este estudio aportó importantes y robustos datos científicos al conocimiento de la composición química y del potencial antioxidante, antiinflamatorio y citotóxico de diversas especies del género Guadua que aún no habían sido estudiadas.
Diferencias sexuales mediadas por la actividad estrogénica endógena en astrocitos humanos sometidos a estrés metabólico con ácidos grasos
(Pontificia Universidad Javeriana) Hidalgo Lanussa, Oscar Alejandro; Sampaio Barreto, George Emilio; Tapia Gonzales, Silvia; Arevalo, Maria Angeles; Diz Chavez, Yolanda; Costa Lima, Silvia; Dias Costa, Maria de Fatima
La prevalencia en el desarrollo de enfermedades que afectan el sistema nervioso central (SNC) cada día es más alta, enfermedades neurodegenerativas como la de Parkinson y Alzheimer, traumas de tipo agudo como la isquemia cerebral o la neuro inflamación representan una alta morbilidad en la población mundial. Múltiples son los factores de riesgo son asociados al desarrollo de estas enfermedades, desordenes metabólicos, infecciones, procesos inflamatorios, entre otros. Uno de estos, es la obesidad, patología representada por un aumento de grasa, capaz de aumentar los niveles plasmáticos de ácidos grasos (AG), que consecuentemente pueden ingresar al cerebro y desencadenar procesos tóxicos asociados a un daño oxidativo e inflamatorio. Interesantemente, tanto para enfermedades que afectan el SNC como para desordenes metabólicos la incidencia está relacionada al sexo, en donde la respuesta metabólica es diferente en mujeres y hombres, lo que podría ser un problema a la hora de determinar algún tipo de tratamiento. Son muy pocos los estudios en investigación básica que tienen el dimorfismo sexual como una variable; uno de los principales enfoques en la caracterización de la respuesta sexual es el estudio del componente hormonal endógeno, en donde los niveles estrogénicos son fundamentales en la respuesta celular. La enzima aromatasa la cual puede regular los niveles de estradiol, estrógeno ampliamente conocido por sus propiedades protectoras en el SNC. La modulación de la aromatasa contribuye al estudio de las diferencias sexuales mediadas por el componente hormonal endógeno en el cerebro, con el ánimo de proponer mecanismos terapéuticos más efectivos, específicos y selectivos en la prevención o tratamiento de patologías que afecten el SNC. Los astrocitos cumplen funciones esenciales en el SNC como la regulación homeostática, el aclaramiento sináptico y el control del flujo sanguíneo cerebral, sin embargo, también desempeñan funciones bioenergéticas, antioxidantes y metabólicas brindando apoyo para las neuronas. Las mitocondrias en los astrocitos utilizan los AG como principal fuente de obtención de energía a través del proceso de β-oxidación, bajo un estricto control enzimático a nivel mitocondrial y peroxisomas. Un aumento en la concentración de AG puede ocasionar la desregulación de diversos procesos celulares, causando entre otras, alteraciones metabólicas, estructurales y funcionales a nivel mitocondrial, que contribuyen a la disfunción mitocondrial, una de las principales características encontradas en la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas y lesiones del SNC. El exceso de AG que se presenta en un escenario lipotóxico es regulado a nivel celular por los “lipid droplets” (LD) orgánulos celulares encargados de mantener un equilibrio lipídico entre los procesos de oxidativos y de almacenamiento de acuerdo con el requerimiento energético. Además, tienen una interacción directa con la mitocondria mediada por PLIN5, una proteína de superficie que controla estos procesos. PLIN5 puede regular procesos oxidativos mediados por la activación de Sirt y de varios factores de transcripción (Pparα y Pgc1-α), de igual manera mediante un mecanismo de unión competitiva puede atenuar a la lipasa ATGL, interactuando con CGI:58 un coactivador de la lipasa. Teniendo en cuenta lo anterior, presumimos que la actividad estrogénica endógena en los astrocitos humanos puede regular directa o indirectamente la función mitocondrial, en situaciones lipotóxicas favoreciendo la protección celular dependiente del sexo. Nuestros resultados indicaron que altas concentraciones de ácido palmítico (AP) afectó significativamente la viabilidad, el funcionamiento mitocondrial (estrés oxidativo, integridad, proteínas antioxidantes, etc.) en mayor medida a los astrocitos de hombre. Por otro lado, encontramos una expresión diferencial sexual del componente estrogénico en los astrocitos (receptores, enzimas), en donde el AP induce la expresión de la enzima aromatasa en los astrocitos. Estas acciones del ácido graso están acompañadas por una reducción en el almacenamiento de los LD, promoviendo un incremento en el metabolismo oxidativo observado por el aumento de Sirt1 y Pparα sobre todo en astrocitos masculinos. Adicionalmente, el AP redujo la expresión de la proteína PLIN5 en hombres, la cual modula el equilibrio del metabolismo lipídico. Interesantemente, el tratamiento con estradiol (E2) aumentó la expresión de PLIN5, sugiriendo un papel protector de este estrógeno. Por último, el silenciamiento parcial de la aromatasa implicó una mayor susceptibilidad de estas células al ser estimuladas con AP, reduciendo la viabilidad e incrementando el estrés oxidativo en comparación con las células control. De igual manera, la reducción endógena de estradiol incrementó la formación de los LD y redujo la expresión de PLIN5; por el contrario, se indujo un metabolismo más oxidativo posiblemente como un mecanismo de compensación a la reducción de estradiol. En conclusión, nuestros resultados sugieren que las diferencias sexuales en la respuesta de los astrocitos son evidentes, en donde las células masculinas se ven mucho más afectadas a nivel mitocondrial ante altas concentraciones de ácidos grasos. También, la reducción de la aromatasa provocó una mayor vulnerabilidad en los astrocitos al AP, revalidando la importancia y el efecto protector del estradiol endógeno.
Rol de los microRNAs (miRNAs) 451a y 1225-5p en la progresión del cáncer mamario
(Pontificia Universidad Javeriana) Hernández Velandia, Yohany Andres; Aristizabal Pachón, Andres Felipe; García Robles, Reggie; Garcia Florez, Manuel; Rondón, Sandra Milena; Serrano Gomez, Silvia Juliana; Umaña Perez, Adriana; Salazar Gutierrez, Fredy Roberto
La progresión tumoral obedece a las habilidades y capacidades de las células tumorales de desencadenar mecanismos bioquímicos, físicos y mecánicos que favorecen su proliferación en un microambiente altamente especializado que contiene una variedad de biomoléculas y células las cuales logran un ambiente favorecedor para la progresión tumoral. Dentro del conjunto de moléculas disponibles en el microambiente tumoral, se encuentran los microRNAs, definidos como RNAs cortos no codificantes con actividad biológica en la regulación génica en condiciones normales y patológicas. Estudios previos han demostrado y validado los mecanismos biológicos que permiten el desarrollo placentario normal y como estos procesos se presentan similares a escala molecular respecto al desarrollo y progresión tumoral. Un conjunto de microRNAs han sido evaluados previamente y se ha propuesto su rol en el proceso autorregulado de desarrollo placentario, dentro de los cuales se encuentran el hsa-hsa-miR-451a y hsa-miR-1225-5p. Con base a lo anteriormente expuesto y de acuerdo con el siguiente objetivo “Determinar el rol de los microRNAs hsa-hsa-miR-451a y hsa-miR-1225-5p en la progresión del cáncer mamario”, se pretende responder la problemática. Para poder darle alcance al objetivo propuesto, planeamos una serie de aproximaciones metodológicas, las cuales abarcaron herramientas bioinformáticas que permitieron descargar y analizar los datos de repositorios de datos públicos validados, inicialmente con el fin de validar en tumores mamarios la ausencia de expresión de los microRNAs de este proyecto, y adicionalmente, seleccionar los genes blanco de los microRNAs estudiados. Para evaluar el rol funcional de los microRNAs, fueron seleccionadas 4 líneas celulares tumorales caracterizadas correspondientes a subtipos moleculares: MCF7 luminal A; BT474 luminal B; MDA-MB-231 triple negativo; MDA-MB-453 receptor andrógeno positivo, receptor de progesterona negativo, receptor estrógeno negativo. Todas fueron transfectadas con microRNAs sintéticos (mimics®) de hsa-miR-451a y hsa-miR-1225-5p (ThermoFisher Scientific). Una vez confirmada la transfección, se ejecutaron los ensayos funcionales de proliferación, sobrevida, migración e invasión. Luego, determinada la ausencia de la expresión de los microRNAs en las líneas celulares tumorales mamarias, esas líneas denominadas como control y transfectadas fueron evaluadas para los procesos clásicos de progresión tumoral. Se evidenció la actividad biológica del hsa-miR-451a en las líneas celulares MCF7, BT474, MDA-MB-231 y MDA-MB-453, donde la expresión de este microRNA generó una disminución significativa de la proliferación, la sobrevida, la migración y la invasión celular, respecto a las células control (p<0,05). La actividad biológica del hsa-miR-1225-5p en las líneas celulares MC7 y BT474 mostró una disminución significativa en los resultados de los ensayos funcionales ya descritos, los cuales están relacionados con la progresión tumoral, respecto a las células control (p<0,05). Para el caso de las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se encontró un aumento significativo en los resultados de las pruebas funcionales, cuando las células fueron transfectadas en relación con las células control (p<0,05). Con base en los análisis previos bioinformáticos se evaluó la actividad biológica de los microRNAs seleccionados, mediante análisis de posibles blancos génicos y enriquecimiento de vías de señalización celular relacionadas con procesos de proliferación, migración, invasión y supervivencia celular. Se encontró interacción entre el hsa-miR-451a y los genes AKT1, CAB39 y BRAF, intermediarios en la vía de señalización MAPK, AMPK y MEK/ERK. Para el hsa-miR-1225-5p se encontró interacción con los genes LASP1, MYC, PEG10, los cuales se encuentran inmersos en la vía de señalización TGF-Beta y β-catenina. La expresión génica de los 6 blancos fue evaluada por qPCR, mostrando disminución/ausencia de la expresión en las células transfectadas con los microRNAs.
Perfil de expresión génica en los grupos de riesgo de recurrencia bioquímica en pacientes con diagnóstico de adenocarcinoma de próstata
(Pontificia Universidad Javeriana) Acosta Vega, Natalia Lizeth; Gómez Gutiérrez, Alberto; Combita Rojas, Alba Lucía; Zabaleta, Jovanny
Introducción. Un gran número de tumores de cáncer de próstata (CaP) diagnosticados son indolentes y nunca se volverán agresivos durante la vida del paciente. Por el contrario, un tercio de los tumores experimentarán una recaída postoperatoria de la enfermedad, con recurrencia bioquímica (BCR), y en una fracción de ellos la progresión hacia enfermedad metastásica conducirá a la muerte asociada a CaP. El CaP es el más incidente y una de las principales causas de mortalidad por cáncer en hombres; por lo tanto, biomarcadores confiables pueden ayudar en la toma de decisiones y evitar el CaP mortal resistente a la castración (CRPC). Nuestro objetivo fue identificar genes con expresión diferencial (DEGs) asociados a BCR y a subtipos moleculares en CaP, y evaluar su capacidad de predicción de la supervivencia libre de BCR en pacientes latinoamericanos con CaP. Métodos. Se incluyeron 117 casos con CaP localizado/regionalmente avanzado. El ARN se extrajo para secuenciación, a partir de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (FFPE) de prostatectomías radicales (RP), y se utilizó para el análisis de expresión diferencial e identificar los DEGs. Se utilizó el modelo de riesgo proporcional de Cox para establecer la fórmula de medición del riesgo con la expresión de los genes seleccionados y, por medio de ésta, clasificar a los pacientes en grupos de alto riesgo (HR) y bajo riesgo (LR) para BCR. De la misma manera, los DEGs asociados a subtipos moleculares se evaluaron mediante análisis univariados para el evento de supervivencia libre de BCR. Se realizaron análisis multivariados para determinar la asociación entre los predictores génicos y la supervivencia libre de BCR, y los niveles de expresión génica se validaron mediante PCR en tiempo real. MetaCore se utilizó para el análisis de enriquecimiento. Resultados. Identificamos 14 DEGs entre casos BCR y no BCR, de los cuales se seleccionaron tres, POTEJ, NEFH y EMX2 y se demostró que estuvieron asociados con BCR. Utilizando la fórmula de medición del riesgo construida con los tres DEGs, los pacientes fueron divididos en HR y LR con diferencias estadísticamente significativas para la supervivencia libre de BCR (BFS) a 5 años. Se confirmó que la firma de tres genes es un predictor independiente de BFS. Los subtipos tumorales de ERG (ERGhigh vs. ERGlow) presentaron diferencias en la BFS que fue estadísticamente significativa. El gen HPGD se expresó diferencialmente entre los dos subtipos y, según su expresión, se asoció al riesgo de supervivencia libre de BCR solo dentro del subtipo ERG alto. El subtipo ERGlow presentó mal pronóstico independientemente de la expresión de HPGD. El análisis de enriquecimiento sugirió que el perfil de BCR está involucrado en las vías de señalización relacionadas con la diabetes tipo 2, el mecanismo de acción cooperativa de pioglitazona/metformina y rosiglitazona/metformina en la diabetes tipo 2 y el metabolismo de los andrógenos. Conclusiones. Nuestro análisis revela una nueva firma de tres genes asociada con la recurrencia bioquímica. Esta firma de tres genes, conformada por POTEJ, NEFH y EMX2, pudo predecir la supervivencia libre de BCR a 5 años en pacientes colombianos con cáncer de próstata localizado/regionalmente avanzado. Además, nuestros hallazgos sugieren que la expresión de ERG y HPGD puede predecir la progresión de la enfermedad posterior a la prostatectomía radical.
Study of selected genes and enzyme activity during chondrogenesis in mesenchymal stromal cells
(Pontificia Universidad Javeriana) Gutiérrez Gómez, María Lucía; Barrera, Luis Alejandro; Groot, Elena; Correa, Diego; Hodge, Deborah; Briceño, Ignacio; Samudio, Ismael
Análisis de la glicoproteina B de los Alphaherpesvirus bovinos 1 y 5 como candidata vacunal contra la rinotraqueitis infecciosa bovina
(Pontificia Universidad Javeriana) Quintero Barbosa, Juan Sebastian; Gutierrez Fernandez, Maria Fernanda; Almeciga Diaz, Carlos Javier; Ceriani, Carolina; Rengifo, Maria Camila; Marin, Maia; Berna, Andrea Elizabeth; Castillo, Jorge Andres
Los virus del herpes bovino (BoHV 1 y BoHV-5) son los agentes causantes de la Rinotraqueitis Bovina Infecciosa (IBR) y la Meningoencefalitis Bovina. Ambas enfermedades son responsables de importantes pérdidas económicas en la industria ganadera. Diferentes autores han reportado que la vacunación para mejorar la inmunidad es el medio más directo y efectivo para prevenir estas enfermedades. En estos últimos años varios grupos de investigación se han centrado en las glicoproteínas de envoltura como candidatos vacunales potenciales, en muchos casos obteniendo resultados que apoyan a estas moléculas como blancos de la vacunación. La glicoproteína B (gB) de la envoltura es esencial en los primeros pasos de infección por BoHV a las células epiteliales del tracto respiratorio superior y genital de los bovinos. Esta glicoproteína es uno de los principales antígenos candidatos para una potencial vacuna recombinante ya que podría inducir una respuesta inmune humoral neutralizante evitando la adhesión y posteriores etapas del ciclo de los virus. Para iniciar el estudio se evaluó la prevalencia viral en ganado del departamento de Sucre encontrando una seroprevalencia del 91,66% (55/60) en los animales muestreados. Más adelante se seleccionó́ la gB del BoHV-1 y BoHV-5 y se caracterizó en términos de función, estructura y antigenicidad a través de herramientas bioinformáticas mostrando secuencias y estructuras conservadas. Con estos resultados se seleccionaron los dominios denominados PH Like 1 del BoHV-1 y PH Like 2 del BoHV-5 para el diseño de un candidato vacunal bivalente. El estudio inmunoinformático de esta quimera candidata mostró que estos dos dominios tienen epítopos conformacionales y lineales reconocibles por los linfocitos B y también poseen epítopos para linfocitos T. A continuación, el ADN codificante para estos dominios se insertó en el plásmido pPICZAlphaA y se transformó la levadura Komagataella phaffii GS115 con la secuencia del candidato vacunal DgB, se testeo la producción especifica mediante Dot Blot para posteriormente purificar por cromatografía de afinidad y cuantificar por BCA el producto obtenido, por medio de un Western Blot se corroboró la purificación de una proteína recombinante con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa a partir de la purificación medio de cultivo. Con este producto se inocularon cada 15 días ratones con DgB adyuvada con Montanide 50 ISA V2 o hidróxido de aluminio. Al primer grupo se le administró por vía intramuscular DgB + Montanide 50 ISA V2, el segundo grupo recibió por vía intramuscular DgB + Hidróxido de aluminio, el tercer grupo se inoculó por vía subcutánea con DgB + Montanide 50 ISA V2 y al cuarto grupo se le administró por vía subcutánea DgB + Hidróxido de aluminio. Un grupo de control se inoculó con PBS y otro grupo recibió una vacuna comercial, ambos fueron inoculados por vía subcutánea. Se obtuvieron sueros de los ratones y se realizaron pruebas de seroneutralización viral contra BoHV-1, BoHV-5 y una cepa recombinante natural de BoHV. Dentro de los resultados obtenidos se tiene una proteína candidata a vacuna (DgB) que fue reconocida por un anticuerpo monoclonal de un kit ELISA comercial utilizado para el diagnóstico de IBR, lo que puede sugerir que los epítopos se conservan de todo el virus infeccioso. En la seroneutralización viral se obtuvieron títulos más altos de anticuerpos neutralizantes contra BoHV-1, BoHV-5 y una cepa recombinante natural de BoHV con la formulación de vacuna candidata a base de aceite (Montanide ISA 50 V2) administrada por vía intramuscular. Se demostró que los dominios recombinantes de BoHV-1/5 gB tienen propiedades antigénicas e inmunogénicas similares a las de la gB nativa. Los resultados demostraron que la DgB quimérica conservó epítopos importantes que pudieron estimular la respuesta inmune humoral capaz de neutralizar el BoHV-1, el BoHV-5 y la cepa recombinante, lo que sugiere que es un candidato prometedor como antígeno vacunal en una futura y posible vacuna.
Vulnerabilidad de anuros de hábitats contrastantes al incremento de la temperatura ambiental
(Pontificia Universidad Javeriana) Turriago Gonzalez, Jorge Luis; Bernal Bautista, Manuel Hernando; Hoyos Hoyos, Julio Mario; Navas Iannini, Carlos Arturo; Urbina Cardona, José Nicolás; Calderón Espinosa, Marha Lucia; Merino Viteri, Andrés; Catenazzi Giannoni, Alessandro Marco
Es probable que la temperatura ambiental sea uno de los factores abióticos con mayor influencia en la evolución y ecología de poblaciones de organismos ectotermos debido a cómo afecta toda su fisiología. Por lo tanto, comprender los mecanismos fisiológicos que subyacen a las respuestas de los ectotermos es crucial para predecir de manera confiable la vulnerabilidad de estos organismos ante el calentamiento futuro. El objetivo de este trabajo fue estimar la vulnerabilidad de seis especies de anuros de hábitats contrastantes (hábitats abierto y boscoso) ante el incremento de la temperatura ambiental. Para ello, se estudió si los aumentos en la temperatura ambiental, así como el régimen térmico afectan de manera diferencial la tolerancia térmica, el desempeño locomotor y el crecimiento y desarrollo larvario en los dos grupos de especies. Para la tolerancia térmica se estudió el grado de plasticidad del CTmax a través del análisis del curso temporal de su aclimatación, así como la variación en la capacidad de aclimatación. La locomoción se evaluó mediante el análisis del máximo desempeño, las temperaturas óptimas y lo rangos de amplitud térmica. Y por último, para el crecimiento y desarrollo larvario se analizó el tiempo de desarrollo y la morfometría larvaria. El análisis sobre las tolerancias térmicas permitió evidenciar que los renacuajos alcanzaron la máxima aclimatación del CTmax entre uno y tres días, que la exposición a temperaturas altas indujo tasas rápidas de aclimatación y mayor CTmax en contraste con la exposición a temperaturas más bajas, lo cual redujo el tiempo para alcanzar la máxima aclimatación. Además, que las fluctuaciones térmicas generaron CTmax más altos, pero con tasas de aclimatación más lentas, comparado con los renacuajos que experimentaron regímenes de temperatura constante. También, se encontró que las especies de hábitat boscoso tuvieron CTmax más bajos que las especies de hábitat abierto, y en general estas últimas tuvieron mayor capacidad de aclimatación. La tasa de calentamiento lenta generó una disminución del CTmax en las especies de hábitat boscoso, mientras que los renacuajos de hábitat abierto lo aumentaron considerablemente. Con respecto al desempeño locomotor, las especies de hábitat boscoso tuvieron poca respuesta de los parámetros locomotores, mientras que las especies de hábitat abierto tuvieron mayor de capacidad de modificar sus curvas de desempeño térmico ante el aumento de la temperatura y la variabilidad de esta. El régimen constante y la temperatura alta maximizaron el desempeño locomotor de los renacuajos, en contraste con la exposición a temperaturas bajas y fluctuantes. Por último, se encontró que las especies de hábitat boscoso resultaron más sensibles a la variación de la temperatura, puesto que el tiempo de desarrollo y el crecimiento se vieron más afectados en comparación con las especies de hábitat abierto. Las temperaturas altas generaron un incremento de la tasa de desarrollo de las especies, pero a su vez generaron larvas más pequeñas, en comparación con las expuestas a las temperaturas bajas. También, el régimen fluctuante a diferencia del constante afectó negativamente el tiempo de desarrollo y el crecimiento larvario. Estos resultados en conjunto permiten concluir que las especies de hábitat boscoso tienen limitada plasticidad fenotípica para hacer frente al potencial estrés por calor derivado del cambio climático global, mientras que las especies de hábitat abierto podrían hasta cierto punto, mitigar el estrés por calor a través de la aclimatación. Sin embargo, las temperaturas ambientales en los hábitats abiertos están muy cerca de los limites térmicos y las temperaturas optimas de las especies, con lo cual los índices de vulnerabilidad apuntan a que estas especies estarían en peligro ante las futuras condiciones climáticas. Particularmente, esto indicaría que estas especies podrían enfrentar en un estrés agudo por calor y un estrés crónico debido a que las temperaturas optimas, aunque están por encima de la temperatura media del hábitat, la alta variabilidad hace que estén expuestas a temperaturas muy por encima de sus óptimos. No obstante, aunque para las especies de hábitat boscoso los índices indican un bajo riesgo de estrés agudo por calor, y un riego moderado por estrés crónico, si sus hábitats son alterados y cada vez más convertidos en áreas con menor cobertura vegetal, su riesgo sería mucho mayor.
Estudio de la rickettsiosis transmitida por garrapatas en zonas rurales del departamento del Cauca y la importancia de Amblyomma patinoi en la epidemiología de la enfermedad
(Pontificia Universidad Javeriana) Martinez Diaz, Heidy Carolina; Hidalgo Diaz, Marylin Eliseyev; Ramirez Hernandez, Alejandro; Polo Infante, Gina Paola; Cortés Vecino, Jesus; Troyo Rodriguez, Adriana; Borges, Francisco; Diaz Castrillon, Francisco Javier
Las rickettsiosis son entidades clínicas de tipo zoonótico. Actualmente hacen parte de las enfermedades desatendidas en salud humana y animal. Los agentes causales son bacterias del género Rickettsia transmitidas por vectores (piojos, pulgas, ácaros picadores y garrapatas) siendo estas últimas el segundo vector más importante después de los mosquitos en la transmisión de agentes infecciosos. En Colombia el estudio de estas enfermedades se ha concentrado en regiones del centro y noroccidente, mientras en el suroccidente los estudios son escasos. En el departamento del Cauca existen reportes de la presencia de vectores y seropositividad en humanos que podrían indicar un posible comportamiento endémico de esta zoonosis en la región. Teniendo en cuenta esta problemática, el objetivo de este estudio fue estudiar la rickettsiosis transmitida por garrapatas en zonas rurales del departamento del Cauca y la importancia de Amblyomma patinoi en la epidemiología de la enfermedad. Se propuso un estudio transversal en ocho zonas rurales priorizadas concentradas en 4 municipios del departamento de Cauca. Se realizó una visita en todas las casas de las veredas, a las personas que cumplieron con los criterios de inclusión y firmaron el consentimiento informado se les recolectó una muestra de sangre, así como a los animales domésticos (perros y caballos) encontrados en el predio; de igual forma se removieron manualmente las garrapatas encontradas sobre estos. Se detectaron anticuerpos IgG contra rickettsias del grupo de las fiebres manchadas en sueros de animales y humanos; las garrapatas fueron identificadas taxonómicamente por claves morfológicas y molecularmente usando genes específicos (16S-rRNA, COI-1 y ITS-2). A partir del DNA extraído de estas se realizó la búsqueda de genes rickettsiales (gltA, sca5, htrA) y bajo condiciones experimentales se realizaron ensayos de competencia vectorial de A. patinoi y un acercamiento del efecto de la infección de Rickettsia rickettsii sobre genes seleccionados del sistema inmune en esta garrapata. Se obtuvo una seropositividad del 85,7%, 80,4% y 90,6% en humanos, perros y caballos respectivamente. Se confirmó la circulación de Amblyomma patinoi, Rhipicephalus sanguineus s.l., Rhipicephalus microplus y Dermacentor nitens en la región explorada y se identificó Rickettsia felis, Rickettsia asembonensis y Candidatus Rickettsia senegalensis en D. nitens, así como R. asembonensis en A. patinoi. Así mismo se confirmó la competencia vectorial de A. patinoi en la transmisión de R. rickettsii a hospederos susceptibles en condiciones de laboratorio, donde se evidenció que la presencia de hospederos amplificadores es una condición necesaria para el mantenimiento enzoótico de la bacteria. De otro lado se estableció que la infección por R. rickettsii en A. patinoi, reprime la expresión de algunos genes importantes del sistema inmune de esta garrapata, los cuales son necesarios en el control de la proliferación de patógenos en sus tejidos. Con estos hallazgos se confirma la circulación de especies de rickettsias en las zonas rurales seleccionadas en el estudio, así como la presencia y competencia vectorial de uno los vectores más importantes en la epidemiología de la rickettsiosis en Colombia. Son necesarios estudios de mayor alcance en esta región que clarifiquen otros componentes relevantes de esta zoonosis.
Caracterización de la respuesta hepática y búsqueda de biomarcadores en el pez neotropical Aequidens metae expuesto a hidrocarburos aromáticos policíclicos
(Pontificia Universidad Javeriana) Corredor Santamaría, Wilson; Velasco Santamaría, Yohana María; Arbeli, Ziv; García Reyero Vinas, Natalia; Navarro Martín, Laia; Smircich Ruzo, Pablo; González Santos, Janneth; Trudeau, Vance
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son contaminantes ambientales omnipresentes. Están catalogados como contaminantes prioritarios por su toxicidad. En Colombia, la región de la Orinoquia genera la mayor parte del petróleo del país, y cada día esta actividad minera produce miles de litros de aguas residuales, conocidas como aguas de producción, ricas en HAP que se vierten en los cuerpos de agua naturales como el Rio Acacias. Para evaluar el impacto de los aguas de producción, sobre los organismos acuáticos, se realizaron monitoreos en el río Acacias, fueron capturados ejemplares silvestres de acará amarilla Aequidens metae (Pisces: Cichlidae), (n = 12) en tres sitios del río y en un cuerpo de agua de referencia en diferentes temporadas de precipitación. También, se evaluó el efecto de la exposición vía inyección intraperitoneal de concentraciones subletales de 4 HAP en el pez cíclido acara amarilla (Aequidens metae). Se utilizaron seis tratamientos con cinco réplicas: T1 control: sin inyección, T2 control solvente: (aceite de canola), T3 β-naftoflavona: (BNF) 50 µg g-1, T4 naftaleno: (NAP) 100 µg g-1, T5 fenantreno: (PHE) 50 µg g-1 y T6 benzo[a]pireno: (BaP) 10 µg g-1 de peso corporal, diluidos en aceite de canola como solvente. Todos los peces fueron inyectados en un volumen final de 5 µL g-1 de peso corporal. Tras la administración del HAP, los peces de cada tratamiento se distribuyeron aleatoriamente en acuarios. Después del periodo de exposición (72 horas), los peces fueron sacrificados, se extrajo sangre periférica y el hígado de cada pez. El hígado se dividió en 3 porciones para los procedimientos de extracción de RNA, procesamiento histológico y determinación de la actividad 7-etoxirresorufina-o-detilasa (EROD) y se almacenó a -80°C. Los procedimientos se realizaron tanto en las muestras de campo como de laboratorio, a excepción de la extracción de sangre que se efectuó solo en el experimento de laboratorio. Se extrajo el ARN de cada muestra de hígado y se comprobó su integridad y concentración. Las muestras de ARN fueron secuenciadas (RNA-Seq) y las secuencias generadas se ensamblaron en un transcriptoma de novo. Las lecturas se mapearon al ensamblaje y se cuantificó su abundancia. El análisis de genes expresados diferencialmente (GED) mostró modificaciones en la respuesta a cada HAP. Fueron identificados 150, 124, 217, 190, y 165 GED para el control sin inyección, BNF, BaP, NAP, Y PHE, respectivamente. A su vez, el análisis de enriquecimiento identificó 35, 31, 23, y 21 vías KEGG para BaP, NAP, PHE, y BNF, respectivamente. Las cuales se enriquecieron en vías del sistema endocrino; crecimiento y muerte celular, procesos de metabolismo de los lípidos y de carbohidratos; transporte y catabolismo; plegado, clasificación y degradación, transducción de señales; metabolismo de xenobióticos y metabolismo de nucleótidos, entre otros. En general el análisis bioinformático mostró evidencia de efectos tóxicos como proliferación celular anormal y deterioro de la homeóstasis de la glucosa en el tejido hepático en los peces expuestos a los HAP. Con base en los resultados del análisis bioinformático, fueron propuestos genes candidatos de respuesta a la exposición a BaP (tiam2a, kat2a, dtx3lb.2, numb, slc39a14, ctbp2a, y camk2g1), NAP (tiam2a, fthl27, herc3, slc39a14, y cdkn1a), PHE (tiam2a, chka, mboat7, plpp3, aco2, y camk2g1) y BNF (tiam2a, col6a3, hspg2, vwf, psmd4a, y mtor). Los efectos de BaP evidenciados en la respuesta génica incluyeron respuesta inflamatoria, funciones del sistema inmunológico, de degradación de proteínas, relacionados con vías del metabolismo de los aminoácidos, metabolismo de los lípidos, metabolismo de nucleótidos y degradación, y vías metabólicas de cisteína y metionina, degradación de lisina, metabolismo de xenobióticos por citocromo P450, vías procesos de plegado, clasificación y degradación y vías asociadas a procesos de crecimiento y muerte celular. La exposición a NAP indujo la expresión de genes relacionados a la inducción de proliferación celular anormal-carcinogénesis, la señalización celular, la adhesión y conexión célula-célula. Así como a procesos relacionados con ubiquitinación y desubiquitinación de proteínas y degradación proteasomal. Así mismo, se relacionó con los mecanismos de reparación del ADN, organización de la cromatina, ferroptosis y apoptosis. La respuesta transcriptómica a PHE incluyó la actividad de señalización celular, procesos de ubiquitinación, procesos asociados a reparación de daño al material genético. También, se evidenció posible efecto inflamatorio, con participación en procesos celulares como la proliferación, diferenciación y regulación de la transcripción. Además, se relacionó con respuesta inmune y muerte celular por apoptosis. Asimismo, con regulación del ciclo celular y tumorogénesis. Por otro lado, los tejidos hepáticos procedentes de los grupos expuestos a los HAP presentaron alteraciones histológicas reversibles. El grupo expuesto a BaP mostró diferencias estadísticas en la actividad EROD y se hallaron alteraciones genotóxicas en eritrocitos de los grupos expuestos a los 4 HAP. Con respecto a los monitoreos de campo, el sitio de descarga de las aguas de producción y el sitio aguas abajo de la descarga en temporada seca indujeron las mayores alteraciones histológicas y la mayor actividad EROD en los peces del estudio. Los HAP alteraron negativamente la función hepática, por lo tanto, la respuesta génica indujo modificaciones en las principales vías metabólicas con evidencia en las lesiones moderadas y reversibles en el tejido hepático y la presencia de alteraciones nucleares en sangre periférica. Los cambios observados en los niveles de EROD y en la arquitectura hepática encontrados en las muestras de campo fueron corroborados en los ensayos de laboratorio, que a su vez fueron apoyados por la respuesta transcripcional hepática de juveniles de A. metae expuestos a los HAP.
Caracterización clínica y genética de una cohorte de pacientes colombianos con el espectro clínico de la Demencia frontotemporal
(Pontificia Universidad Javeriana) López Caceres, Andrea del Pilar; Zarante Montota, Ignacio Manuel; Matallana Eslava, Diana; Rodriguez, Natalia; Giraldo, Margarita Maria; Briceño Balcazar, Ignacio; García Robles, Reggie
La demencia frontotemporal (DFT) es un síndrome neurodegenerativo de inicio presenil con un cuadro clínico heterogéneo, por lo que su diagnóstico clínico suele ser complicado. El objetivo principal de este proyecto fue caracterizar mediante herramientas, como árbol genealógico y técnicas moleculares, una muestra de pacientes colombianos con diagnóstico de DFT que consultaron al Centro de Memoria y Cognición del Hospital Universitario San Ignacio entre enero del 2012 a diciembre del 2014, e identificar la existencia de una relación entre el genotipo-fenotipo de las variantes genéticas encontradas y las variantes clínicas de la enfermedad. Se realizó un estudio observacional analítico a 159 pacientes evaluados con diagnóstico de DFT, distribuidos en 95 (59,74%) pacientes con variante frontal, 37 (23,27%) con afasia primaria progresiva y 27 (16,98%) con demencia semántica. Al hacer la descripción de la población se evidenció una distribución similar a lo reportado en la literatura. Posteriormente, mediante el panel de secuenciación de nueva generación desarrollado por la Universidad de Pensilvania que evalúa cuatro enfermedades neurodegenerativas, entre estas DFT, se encontraron 13 pacientes con 89 variantes distribuidas en 2 patogénicas, 55 variantes de significado clínico incierto y 32 variantes benignas. Adicionalmente, se evaluaron 7 pruebas neuropsicológicas en los subgrupos clínicos del DFT y se analizó el posible riesgo asociado de las variantes del panel por SNP-array al desempeño en estas pruebas. De los resultados se pudo concluir que, a pesar de las mejoras en el diagnóstico debido a las nuevas técnicas de secuenciación, la DFT es una enfermedad altamente compleja y variable que se solapa con otras enfermedades neurodegenerativas donde más de un gen estaría afectando la penetrancia y la expresividad de la enfermedad, por lo que los paneles diagnósticos para DFT deben incluir, además de los descritos para esta condición, otros genes asociados a enfermedades neurodegenerativas.
Estructura genética, filogeografía y filogenia molecular de tres géneros de pequeños carnívoros neotropicales de la familia procyonidae: (Nasua, Nasuella, Potos), mediante secuencias de genes mitocondriales
(Pontificia Universidad Javeriana) Jaramillo Trujillo, Maria Fernanda; Ruíz García, Manuel; Caballero Gaitán, Susana; Orozco Ter Wengel, Pablo; Pinto Baez, Christian Miguel; Túnez, Juan Ignacio; Rojas Martin, Danny
Procyonidae es una familia de pequeños carnívoros restringida al Neotrópico con amplio éxito de colonización en Sudamérica. Está conformada de acuerdo con las clasificaciones taxonómicas tradicionales por 6 géneros, de los cuales 5 se encuentran distribuidos en el sur del continente. A pesar de que Procyonidae contiene especies relativamente abundantes y reconocidas tales como los mapaches y los coatís, la filogenia y su genética poblacional han sido muy poco estudiada, los trabajos relacionados con estas especies se centran en aspectos comportamentales y ecológicos. Por su parte los estudios genéticos indagan generalmente la filogenia global de la familia y su posición y relaciones al interior de Carnívora, y los pocos que se han realizado a nivel intragenérico e intraespecífico cuentan con pequeños tamaños muestrales, y con distribuciones geográficas muy limitadas. Con respecto al proceso de colonización de Procyonidae en Sudamérica existen principalmente dos hipótesis sobre los tiempos de ingreso de la familia a esta parte del continente, la primera es de origen paleontológica y sostiene que Procyonidae ingresó como parte del Gran Intercambio Biótico Americano, GABI, después de la formación completa del puente de tierra en Panamá hace aproximadamente 3 millones de años; la segunda se sustenta en la aplicación de relojes moleculares y defiende que los prociónidos antes de la formación del puente panameño, durante el Mioceno ingresaron a Sudámerica, provenientes del norte del continente. Este es el primer estudio molecular (ADN mitocondrial) con un importante tamaño muestral (n=129 Kinkajou, n=345 coatís, n=25 grupos externos (mapaches y olingos) a través de Centro y Sudamérica que indaga las relaciones de filogenia y filogeografía entre los géneros más cercanos y al interior de las especies analizadas (Potos flavus, Nasuella Olivacea, Nasua nasua, Nasua narica), y con el que se pretende esclarecer aspectos filogenéticos, filogeográficos, genético poblacionales y sistemáticos de estos taxones, de manera que se aporte al entendimiento del proceso evolutivo de las especies involucradas y que a su vez permitan entender los modelos de colonización de la familia en general. Se presentan los resultados de la investigación en tres capítulos que abarcan las especies mencionadas, resaltando los siguientes aportes. Se encuentran para P. flavus, 8 grupos bien diferenciados, con fuerte estructura espacial en las poblaciones estudiadas desde centro hasta Sudamérica. Tanto los arboles filogenéticos como la red de haplotipos sugieren que la primera población en divergir es la centro americana, y la más joven es la población boliviana. A diferencia de las hipótesis clásicas paleontológicas esta investigación indica que las divisiones temporales y la diversificación en Potos comenzaron durante el Mioceno. Con respecto a Nasuella, se reporta por primera vez el cariotipo para esta especie. Los análisis moleculares realizados sugieren que la especie propuesta por Helgen et al. (2009). N. meridiensis, hace parte de un acervo genético que se distribuye hasta la cordillera oriental colombiana y hace parte de N. olivacea. Con 345 muestras de coatíes y solo un fragmento del gen ND5 mt, se detectaron 19 haplogrupos principales (10 N. nasua, cinco N. olivacea y cuatro N. narica) y 8-10 subhaplogrupos (cinco y siete N. nasua, y tres N. narica). Mientras con 205 muestras de coatís de mitogenomas completos, se detectaron 15 haplogrupos principales (siete N. nasua, tres N. olivacea y cinco N. narica) y ocho sub- haplogrupos (cinco N. nasua y tres N. narica). Se reporta la primera evidencia molecular de la presencia de N. olivacea en Perú, y se sugiere que muy posiblemente coexistan dos formas diferenciadas de la especie en el mencionado país. Las últimas divisiones temporales ponen en evidencia que la evolución de los coatís en América del Sur es bastante anterior al cierre total del istmo de Panamá alrededor de 3 millones de años (ma) y que su evolución molecular inicial comenzó en América del Sur (y no en América del Norte o Centroamérica) en el Mioceno tardío. Se plantea la opción de determinar un género único (Nasua) que albergue las tres especies de coatís, esto es motivado porque se observa que la trayectoria evolutiva de los coatís es un proceso continuo y no discreto, que se espera entre taxones muy relacionados, como es el caso actual. Esto se ve mejor en la red de haplotipos construida mediante “Median Joining Network” (MJN) que en los árboles filogenéticos. Se presentan evidencias de que Nasua narica de centro américa es el taxón más joven de todos los evaluados, pero adicionalmente se identifica una existencia minoritaria de Nasua narica en Sudamérica, (un individuos de Tama, Norte de Santander Colombia, uno de Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia y tres individuos ecuatorianos proveniente de Fátima-Macas y Guayas en Ecuador), de acuerdo con lo anterior se concluye a diferencia de lo que se ha pensado sobre la distribución de la especie que no está ampliamente distribuido por el pacifico ecuatoriano y colombiano (donde predomina N. nasua así tenga fenotipo de N. narica), pero tampoco está ausente de estas zonas. Finalmente se presentan pequeños indicios de la complejidad sistemática y molecular al interior del género Bassarycion que, si bien no fue objeto directo de la investigación, si se utilizaron 24 muestras como grupos externos.
Caracterización del fenotipo, transcriptoma y repertorio de genes de inmunoglobulinas de células B humanas CD27+IgM+IgD+ circulantes y evaluación de su frecuencia en individuos con apendicectomía y/ó amigdalectomía
(Pontificia Universidad Javeriana) Bautista Lopez, Diana Marcela; Angel Uribe, Juana; Franco Cortés, Manuel Antonio; Arana, Eloisa Irene; Tobón García, Gabriel Jaime; Vasquéz Duque, Gloria Maria; Quijano Gómez, Sandra; Rojas Vasquez, Olga Lucía
Las células B (CB) son un componente primordial de la respuesta inmune innata y adaptativa. Las CB CD27+IgM+IgD+ han sido implicadas en la respuesta inmune frente a diferentes patógenos. Por lo tanto, se hace necesario estudiar en detalle esta población en ausencia de enfermedad, para posteriormente entenderlas en los diferentes contextos patológicos. El origen, función y repertorio de genes de inmunoglobulinas (Ig) de las CB CD27+IgM+IgD+ circulantes en humanos es controversial y ha sido considerada por otros y por nosotros como una población heterogénea. A pesar de que se ha referido dicha heterogeneidad, poco se sabe sobre las fracciones de células que conforman esta población. Trabajos previos del grupo mostraron que las CB CD27+IgM+IgD+ pueden dividirse en dos subpoblaciones con base en la expresión de IgM e IgD: CD27+IgM++IgD+ (IgMhi) y CD27+IgM+IgD++ (IgMlo) y que las CB específicas de rotavirus están enriquecidas en la subpoblación IgMhi. Otro estudio dividió estas poblaciones de manera similar y evaluó su fenotipo, pero no existe información acerca del transcriptoma, del repertorio de genes de Ig y de su localización, entre otros. Por lo anterior, en este trabajo se comparó el transcriptoma y repertorio de genes de Ig de CB humanas circulantes IgMhi e IgMlo en adultos sanos y se evaluó la frecuencia y la expresión de marcadores de migración en células provenientes de individuos con antecedentes de apendicectomía y/ó amigdalectomía e individuos sin estos antecedentes. El análisis del transcriptoma se realizó mediante el arreglo Clariom D de affymetrix. Para la evaluación de los genes de Ig se amplificaron inicialmente las secuencias de interés mediante 5’RACE-PCR y las librerías generadas se sometieron a secuenciación utilizando la plataforma MiSeq de Illumina. El análisis de secuencias fue realizado usando IgRec e IMGT. Por otro lado, se configuró un panel de 24 colores para evaluar la expresión de marcadores de migración y otros marcadores por citometría espectral. El análisis transcriptómico mostró que ambas poblaciones tienen perfiles cercanos entre sí y con poblaciones que han pasado por el centro germinal, pero difieren en la expresión de 78 genes. Las CB IgMhi tuvieron frecuencias mutacionales más altas en los genes IGHV e IGKV que las IgMlo, pero las IgMlo presentaron un uso preferencial por el segmento IGHJ6. Ambas poblaciones difirieron en sus propiedades del HCDR3, pero las CB IgMhi compartieron la mayoría de sus clonotipos IGH con las CB de memoria solo IgM, y las IgMlo con las solo IgM. Fenotípicamente, estas poblaciones fueron diferentes en 14 marcadores, incluidos los marcadores de migración, α4β7, CCR9 y CD22. Además, identificamos menores frecuencias de CB IgMlo y CB IgMhi en individuos apendicectomizados y/ó amigdalectomizados. Estos resultados apoyan la idea de que la expresión diferencial de IgM e IgD discrimina dos subpoblaciones de CB CD27+IgM+IgD+ circulantes: las CB IgMhi tienen similitudes con CB de la zona marginal que han pasado por centro germinal y las CB IgMlo son menos diferenciadas. Las menores frecuencias de las CB IgMhi y CB IgMlo y células IgMhi que expresan CCR9 en individuos apendicectomizados y/ó amigdalectomizados sugiere que el apéndice y/ó amígdalas son importantes para el desarrollo de estas células.
Caracterización genómica, proteómica y de la virulencia de aislamientos clínicos de Cryptococcus neoformans var. Grubii : efecto del hierro y el cobre
(Pontificia Universidad Javeriana) Vélez Cuellar, Norida Natally; Monteoliva Díaz, Lucia; Parra Giraldo, Claudia Marcela; Alméciga Diaz, Carlos Javier; Pla Alonso, Jesus; Giusiano, Gustavo; Firacative, Carolina; Gonzales Marin, Ángel Augusto
Caracterización genómica, proteómica y de la virulencia de aislamientos clínicos de Cryptococcus neoformans var. grubii: efecto del hierro y el cobre. Introducción Durante el desarrollo de la enfermedad fúngica invasiva (EFI), los metales participan de manera importante en la interacción entre los hongos y las células del hospedero: el hierro y el cobre actúan como cofactores en múltiples reacciones enzimáticas. Estos metales en la célula fúngica se relacionan de manera importante con la expresión de factores de virulencia gobernados por metaloproteasas. Por otro lado, en el hospedero, son esenciales en la respuesta eficiente de mecanismos efectores, por ejemplo, en las células del sistema inmunológico. Por lo tanto, el éxito en el establecimiento de la EFI pude depender de la capacidad para competir y adquirir metales del entorno del hospedero. La levadura ambiental C. neoformans forma parte del complejo de especies que causa la criptococosis, una micosis oportunista adquirida por la inhalación de propágulos fúngicos presentes en el ambiente. Es una infección potencialmente fatal que afecta los pulmones y el sistema nervioso central. Esta levadura produce infecciones frecuentemente en individuos inmunocomprometidos, por ejemplo, en pacientes con SIDA, con trasplante de órganos o con terapias inmunosupresoras. Los metales son necesarios para las funciones esenciales celulares y los hongos patógenos han desarrollado maquinarias para equilibrar con precisión la delgada línea entre la adquisición de metales esenciales y la defensa contra la toxicidad de estos. El suministro de estos metales dependiendo del ambiente en que se encuentre la levadura puede ser limitado, por ejemplo, el hierro disponible en hospederos mamíferos es extremadamente bajo y en la naturaleza los óxidos de hierro se forman por pH bajos donde la disolución es extremadamente lenta y es dada por la concentración de oxígeno. Asimismo, el cobre en la naturaleza no se encuentra totalmente disponible, ya que en pH básicos disminuye. Este metal normalmente esta enlazado con la materia orgánica y en hospederos mamíferos es limitado. En Cryptococcus neoformans, una de las funciones que desempeñan los metales como el hierro y el cobre es la regulación de la expresión de factores de virulencia como la cápsula o la producción de melanina, por lo que influyen en la infección sistémica exitosa. Objetivo En principal objetivo de esta tesis es caracterizar el genotipo, la virulencia, el proteoma y el efecto del hierro y del cobre sobre la modulación de la patogenicidad en 29 aislamientos clínicos colombianos de Cryptococcus neoformans var. grubii, con el fin de entender su implicación en la virulencia y aportar nuevos datos que ayuden a la predicción de nuevas dianas antifúngicas. Resultados 1. Caracterización genotípica, determinación de la variabilidad patogénica, crecimiento capsular, producción de melanina, suceptibilidad antifúngica y variantes no sinónimas de genes asociados, en aislamientos clínicos. Se genotiparon 29 aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii utilizando el esquema de MLST identificándose 11 secuencias tipo (ST), siendo la ST69 la más frecuente seguida de ST2, ST93 y ST377. A continuación, se evaluó la patogenicidad de los aislamientos en G. mellonella clasificándolas en patogenicidad alta (12), intermedia (10) y baja (7) y se llevó a cabo el análisis de los principales factores de virulencia, como efecto en la cápsula pre y post inoculación en G. mellonella, inducción de la cápsula en MOPS y pigmentación de melanina en L-Dopa. En general en los aislamientos con baja patogenicidad se observaron cápsulas de mayor tamaño (1.730 μm de promedio) respecto a los de alta (0.630 μm) y de intermedia (0.498 μm) patogenicidad. De los 7 aislamientos categorizados con baja patogenicidad se observaron 3 con baja pigmentación, 2 intermedia y 2 con alta pigmentación. También dentro de los aislamientos de alta patogenicidad se incluían aislamientos con todos los niveles de pigmentación, 4 de baja, 3 de intermedia y 5 de alta. Posteriormente, se investigó si con el estudio de las características fenotípicas observadas es posible clasificar los aislamientos clínicos de acuerdo con su patogenicidad. Para ello, se realizó un análisis de componentes principales utilizando las variables de mortalidad, cápsula y pigmentación de melanina, encontrándose relación entre el aumento del tamaño capsular y los aislamientos clasificados como de alta patogenicidad. Además, los aislamientos que se agruparon en las secuencias tipo más frecuentes como la ST69 y ST95 presentaron cápsulas grandes (X:2.42 μm), mientras que los aislamientos de la ST2 y ST377 presentaron cápsulas pequeñas (X:1.03 μm). Seguidamente, se combinaron los datos obtenidos de las variables fenotípicas con genes asociados a los principales factores de virulencia. Tras la secuenciación del genoma completo de los 29 aislamientos clínicos y el análisis de polimorfismos (SNPs) se determinaron 48 variantes no sinónimas asociadas a los fenotipos observados y ubicadas en los dominios funcionales predichos para 39 genes. Entre ellas, se identificaron 48 variantes no sinónimas ubicadas en genes asociados a cápsula, melanina y patogenicidad como PTP1, PMT4, IPK1, PBX2, OVA1 y ROM2; además, en 9 de estos genes los cambios detectados implicaban la aparición de codones de parada. 2. Efecto de hierro y cobre en la patogenicidad, el tamaño capsular y producción de melanina en aislamientos clínicos de alta y baja patogenicidad. En la segunda parte de la tesis se exploró el efecto de hierro y cobre en el crecimiento de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii, en su patogenicidad en G. mellonella, el crecimiento capsular y la pigmentación de melanina. La levadura fue capaz de crecer a concentraciones de hasta 50 μM de hierro y 500 μM de cobre. A continuación, se evaluó la patogenicidad tras el precultivo con hierro y cobre de 10 aislamientos clínicos con diferentes perfiles de patogenicidad basal (sin precultivo con los metales). En el 90 % de los aislamientos aumento la patogenicidad con la combinación de 50+500 μM de hierro y cobre respectivamente. Igualmente, se observó un aumento del crecimiento de la cápsula, se aceleró la producción de melanina y se indujo la aparición de células tipo titán. 3. Análisis proteómico de los cambios inducidos por el hierro y el cobre y determinación de variantes genéticas en genes asociados a estos metales en dos asilamientos de baja y alta patogenicidad. Finalmente, para obtener información de los mecanismos implicados en los rasgos de virulencia inducidos en la combinación con 50 μM hierro y 500 μM de cobre, se realizó un análisis proteómico comparativo de extractos citoplasmático de dos aislamientos clínicos (H0058-I-2807 y H0058-I-3102) con diferente grado de patogenicidad tras su crecimiento en con dichos metales y sin ellos. En el precultivo de 50+500 μM de hierro y cobre se identificaron 1.484 proteínas en el aislamiento clasificado como de baja patogenicidad y 1.549 para el aislamiento de alta patogenicidad. Se detectaron 147 proteínas diferenciales que fueron específicas del precultivo con los metales en los dos aislamientos. Las proteínas diferenciales en el aislamiento de alta. patogenicidad fueron 130 (88 aumentaron y 42 disminuyeron su abundancia) y 198 en el aislamiento de baja patogenicidad (149 aumentaron y 49 disminuyeron su abundancia). Finalmente se detectaron 49 proteínas comunes entre los dos aislamientos: 30 con mayor abundancia, 14 con menor y 5 con diferente cambio según el aislamiento. Las proteínas de los dos aislamientos cultivados en la combinación de hierro y cobre que aumentaron su abundancia están relacionadas entre otros procesos con el estrés celular, tráfico vesicular (Ap-1, Vps35), estructura de la pared celular (Och1, Ccr4, Gsk3), biosíntesis de pigmento (Hem15, Mln2), reparación de ADN (Chk1), transporte de proteínas (Mms2), así como proteína asociada a la SUMOilación (Uba2) y un transportador mitocondrial (Atm1). Por lo tanto, la presencia del precultivo con los metales influye sobre la abundancia de proteínas que están involucradas en la patogenicidad. Conclusiones Los aislamientos clínicos colombianos de C. neoformans var. grubii analizados presentaron diferencias en su capacidad patogénica la cual es multifactorial. Cuando se comparan las características demográficas y fenotípicas de acuerdo con las ST identificadas, queda claro que, en lugar de ser un grupo homogéneo, existe una amplia variabilidad tanto en la capacidad patogénica, como en el tamaño capsular y producción de melanina. Quizás las diferencias patogénicas entre los aislamientos obedezcan a las condiciones ambientales en que el hongo crece, el modelo utilizado y a las condiciones propias del hospedero. Los datos sugieren que el incremento del tamaño capsular es una variable clave para la diferenciación de aislamientos más o menos patógenas, independientemente del método empleado para su inducción. Históricamente la cápsula ha sido ampliamente estudiada dada su capacidad para modular la respuesta inmune del hospedero y los cambios morfológicos de esta estructura se han relacionado con resistencia antifúngicos y a condiciones de estrés, por lo que este proceso es importante para evadir la muerte por parte de las células fagocíticas. En el estudio genómico de los 29 aislamientos clínicos se identificaron variantes no sinónimas que implican 9 codones de parada en genes relacionados con el polisacárido capsular, la síntesis de melanina, el crecimiento, el mantenimiento de la pared celular, la secreción de vesículas extracelulares o la respuesta a estrés. Sería interesante ahondar en el estudio de las consecuencias a nivel de secuencia y función de proteína producidos por las variaciones genotípicas detectadas. Responder y adaptarse a una gran cantidad de estímulos ambientales son habilidades claves que necesita C. neoformans para sobrevivir en nichos biológicos diferentes. El metabolismo de hierro y cobre es de gran importancia en la fisiología de esta levadura dado que interviene en distintos procesos biológicos. Esta es la primera investigación en que se combina el hierro y el cobre en el precultivo de aislamientos clínicos de C. neoformans var. grubii. Con esta aproximación, se comprobó que la combinación de estos metales aumentó la patogenicidad, el tamaño capsular, aceleró la producción del pigmento de melanina e indujo células tipo titán. Además, se observaron cambios proteómicos tras el precultivo con la combinación de 50 μM de hierro y 500 μM de cobre. Se detectó un aumento en la abundancia de proteínas relacionadas con respuesta a estrés oxidativo, integridad de pared celular, trafico vesicular, cápsula y melanina. Es interesante resaltar que el marcado aumento de la patogenicidad puede explicarse en parte por los resultados que indican que existe un vínculo entre el precultivo en combinación de hierro y cobre y cambios en proteínas asociadas a la cápsula, melanina, pared celular y tráfico vesicular. Sin embargo, para comprender mejor este proceso y sus mecanismos moleculares en detalle es necesario continuar explorando la dinámica de los metales en la patogenicidad y virulencia en esta levadura.
Análisis fisiológico y transcriptómico de la respuesta a déficit hídrico en cacao (Theobroma cacao L.) para la identificación de genes candidatos de tolerancia a estrés
(Pontificia Universidad Javeriana) Osorio Zambrano, Mayra Andreina; Terán Pérez, Wilson; Rodriguez Perez, Loyla; Tezara, Wilmer; Yockteng, Roxana; Monneveux, Philippe; Covarrubias, Alejandra; Melgar, Juan Carlos
El cacao (Theobroma cacao L.) es un árbol perenne tropical nativo de la cuenca Amazónica de América del Sur, de gran importancia económica debido a que, de sus frutos, se obtienen las semillas que son la materia prima de la industria chocolatera. Su cultivo representa el principal sustento económico de pequeños agricultores de varias regiones productoras de África, América Central y América del Sur. El cacao es sensible a los cambios en los patrones meteorológicos generados por el calentamiento global, y en los próximos decenios se prevé que la mayoría de las zonas de cultivo serán afectadas por el cambio climático con el aumento de la incidencia de los períodos de limitación hídrica en el suelo. Se caracterizó la respuesta de T. cacao al estrés por déficit hídrico empleando dos aproximaciones la fisiología y la transcriptómica. 1) Se llevó a cabo la caracterización fisiológica de la respuesta al déficit hídrico de siete clones evaluando los parámetros fisiológicos de relaciones hídricas, intercambio de gases y actividad fotoquímica del PSII. Para esto, las plantas fueron sometidas a dos tratamientos: riego a capacidad de campo y déficit hídrico por suspensión de riego hasta que el potencial hídrico de las hojas (Ѱ) alcanzó valores entre -3.0 a -3.5 MPa. Alcanzado este punto de máximo estrés, se reanudó el riego y se evaluó su recuperación. De esta caracterización se seleccionaron los clones EET8 e ICS60, por ser los más contrastantes en cuanto a sus parámetros fotosintéticos, junto con el clon TSH565 que mantuvo el mayor Ѱ a pesar de la limitación hídrica. Estos clones fueron sometidos a una segunda evaluación fisiológica de la respuesta al estrés donde, además de los parámetros fisiológicos empleados en la primera caracterización, se evaluaron parámetros de crecimiento. Los resultados mostraron que EET8 fue el más afectado, presentando el Ѱ más bajo, así como una mayor reducción en la fotosíntesis neta y afectación en el aparato fotosintético, lo que se reflejó en la mayor reducción en su crecimiento. En contraste, el clon TSH565 tuvo la mayor eficiencia en el uso del agua y la menor afectación en el aparato fotosintético y por lo tanto en el crecimiento. Con estos dos clones se realizó la 2) Caracterización molecular a nivel transcriptómico de la respuesta al déficit hídrico, para identificar genes candidatos de tolerancia a este estrés en cacao. Se empleó la secuenciación de ARN (RNAseq) a partir de ARNm total foliar de los clones mencionados. El análisis de expresión diferencial entre la condición de estrés y su respectivo control permitió identificar un número similar de genes diferencialmente expresados entre los dos clones, muchos de ellos compartidos, así como otros específicos de la respuesta de cada clon. El análisis de enriquecimiento funcional y de rutas metabólicas permitió evidenciar que la respuesta de tolerancia al estrés observada en el clon TSH565, estuvo relacionada con su capacidad para activar de forma específica genes de XVIII respuesta a estrés, y de respuesta a estímulos, sobresaliendo la activación de rutas de señalización hormonal como la del ABA, la fosforilación de proteínas, o las categorías de unión a ácidos nucleicos y de funciones catalíticas, las cuales reflejan un importante proceso de reprogramación tanto de la expresión génica, como metabólica. El clon EET8 también toleró el déficit hídrico, las categorías funcionales enriquecidas estaban relacionadas con procesos metabólicos muy diversos, de biosíntesis y de respuesta a estímulos abióticos, bióticos y químicos. Además, en este clon se encontraron reprimidos algunos genes relacionados con la estabilidad del aparato fotosintético, las reacciones lumínicas de la fotosíntesis y el transporte de electrones en el fotosistema I, confirmando lo observado a nivel fisiológico en cuanto a afectación del aparato fotosintético debido al estrés. Se evidenciaron mecanismos comunes y específicos de respuesta a DH entre clones, permitiendo proponer un modelo de respuesta mediante la integración con las respuestas observadas a nivel fisiológico. Finalmente, esta caracterización integrada, permitió identificar una selección de genes candidatos que podrían estar relacionados con la tolerancia de T. cacao al déficit hídrico. Estos resultados representan un primer aporte al conocimiento de la respuesta transcriptómica del cacao al déficit hídrico, y el primer reporte de la caracterización de los mecanismos fisiológicos y moleculares de su tolerancia a este estrés abiótico. La caracterización de la respuesta de clones híbridos de importancia comercial, pero, sobre todo, el recurso genómico generado, así como los genes candidatos de tolerancia identificados, en espera de su validación, constituyen un insumo valioso para los programas de mejoramiento del cacao, en búsqueda de materiales más tolerantes a las nuevas condiciones climáticas.
Papel del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas C (PDGF-CC) sobre mecanismos celulares asociados a un modelo de disfunción endotelial inducida por alta concentración de D-glucosa
(Pontificia Universidad Javeriana) Grismaldo Rodríguez, Mabel Adriana; Morales Álvarez, Ludis del Rosario; López Casillas, Marcos; Landázuri, Patricia; Mejía Naranjo, Wilson; Bautista Niño, Paula; Velandia Romero, Myriam
Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de muerte a nivel mundial. Uno de los factores de riesgo asociados a la aparición de estas enfermedades es el aumento anormal de los niveles de glucosa en plasma (hiperglicemia) que ocurre en pacientes con enfermedades metabólicas como la diabetes mellitus. Una característica común a todas las patologías vasculares es la presencia de un fenotipo endotelial alterado, conocida como disfunción endotelial; en pacientes diabéticos, esta condición ha sido atribuida a las condiciones de resistencia a la insulina e hiperglicemia. La hiperglicemia induce disfunción endotelial por aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno citosólicas, y principalmente, en la cadena de transporte de electrones mitocondrial. En este contexto, la búsqueda de moléculas exógenas o endógenas que protejan al endotelio vascular de los efectos dañinos producidos por la hiperglicemia se establece como un campo amplio en investigación para el hallazgo de blancos terapéuticos importantes para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Publicaciones recientes proponen a PDGF-C como una nueva molécula que ejerce múltiples efectos positivos sobre células endoteliales, principalmente en procesos de angiogénesis e incluso en condiciones de diabetes; sin embargo, sus efectos sobre otros mecanismos asociados a disfunción endotelial no están completamente descritos. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto de PDGF-C sobre las alteraciones deletéreas inducidas por altos niveles de D-glucosa en células endoteliales, entre los que se incluyeron: estrés oxidativo y evaluación de la expresión del factor de transcripción Nrf-2 involucrado en respuesta antioxidante, modulación de la red mitocondrial asociada a la expresión de proteínas de fusión y fisión, activación de la sintasa de óxido nítrico endotelial y producción de óxido nítrico, producción de endotelina-1 y evaluación de las vías de señalización PI3K/Akt y MAPK asociadas a la producción de este vasodilatador y vasoconstrictor, respectivamente. Los resultados de este estudio indican que PDGF-C redujo la producción de ROS mitocondrial inducida por alta concentración de D-glucosa y que este efecto estuvo asociado al aumento en la expresión y actividad de la enzima antioxidante SOD2; en las mismas condiciones, PDGF-C redujo la expresión relativa del gen Keap1, involucrado en la retención de Nrf2 en el citoplasma. PDGF-C atenuó la fragmentación de la red mitocondrial inducida por alta concentración de D-glucosa, indujo la expresión de la proteína de fusión mitocondrial OPA1 y moduló la fosforilación de los residuos Ser616 y Ser637 de la proteína de fisión DRP1, conocidos por promover y atenuar la fisión mitocondrial, respectivamente. PDGF-C indujo la activación de eNOS por fosforilación del residuo Ser1177; sin embargo, no se observó fosforilación de Akt ni producción de NO inducida por PDGF-C. PDGF-C moduló la fosforilación de las proteínas ERK1/2 y disminuyó los niveles de ET-1, producidos en condiciones de alta D-glucosa. Estos resultados sugieren que PDGF-C puede ser considerado un blanco terapéutico prometedor en patologías cardiovasculares asociadas a patologías metabólicas como la diabetes mellitus, ya que ejerce un papel reparador sobre los efectos deletéreos que altas concentraciones de glucosa inducen sobre el endotelio vascular.
Transcriptomic Analysis of synthetic steroid tibolone against a lipotoxic Insult with palmitic acid in normal human astrocytes
(Pontificia Universidad Javeriana) Martin Jimenez, Cynthia Alexandra; Gonzalez Santos, Janneth; Ramírez, David M.; Cala Molina, Mónica; Yepes, Manuel; Corredor, Mauricio; Arboleda Bustos, Gonzalo
La obesidad genera la acumulación de diferentes lípidos en el organismo, entre ellos el ácido palmítico (AP). Este es es el ácido graso más abundante en el cuerpo humano y su cumulación excesiva ha sido ligada a la progresión de diferentes enfermedades neurodegenerativas, como las Enfermedades de Alzheimer y la Enfermedad de Parkinson. El daño inducido por la AP puede activar una amplia variedad de vías celulares que pueden activar efectos deleterios en el cerebro. Asi, se ha concluidio en varios trabajos que este acido graso puede llegar a generar efectos deletereos que llegan a afectan los astrocitos y su correcto acople metabolico con las neuronas. Es importante destacar que estas celulas gliales son actores principales en el mantenenimiento de la homeostasis cerebral y cuando son afectadas negativamente pueden favorecer el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. En ese punto es importante destacar que los aestrógenos se han utilizado para tratar diferentes daños en el sistema nervioso central. Los astrocitos tienen receptores especificos estrogenicos los cuales se han reportado que modulan diferentes efectos neuroprotectores como la reducción del daño inducido por el estrés oxidativo, inflamación, inducen la liberación del factor neurotrófico y la supervivencia celular entre otras. Sin embargo, los ensayos clínicos han revelado que el reemplazo de la terapia hormonal con estrógenos aumenta la incidencia de cáncer de útero y de mama. Por lo tanto, se han evaluando estrategias alternativas para inducir los efectos protectores del estrógeno y sin sus efectos secundarios mencionados anteriormente. En ese sentido, la Tibolona se ha perfilado como un posible agente terapéutico debido a sus efectos neuroprotectores previamente reportados. Sin embargo, los mecanismos celulares de esos efectos no se comprenden completamente. Asi mismo no se ha investigado la respuesta transcripcional global de los astrocitos humanos al estrés lipotóxico producido por el acido palmitico. En ese punto un enfoque de biología de sistemas que se valga de un acople a herramientas transcriptómicas condujo a una mejor comprensión de los procesos involucrados en el daño causado por el ácido palmítico y la respuesta protectora de la tibolona. En este estudio, se realizó una caracterización de la marca transcriptomica global de astrocitos humanos expuestos a concentraciones tóxicas de ácido palmítico y tibolona. El ácido palmítico aumentó la muerte celular y alteró diferentes parámetros celulares provocando un aumento en la producción de superóxido, fragmentación nuclear, oxidación de cardiolipina y reducción del potencial de membrana mitocondrial. Asi mismo, la tibolona atenuó la mayoría de esos daños a nivel celular. Por otro lado, los cambios de expresión fueron concordantes con la acumulación de colesterol y diglicéridos, alteración de la beta-oxidación, alteración de la señalización del ácido lisofosfatídico, citocinas proinflamatorias, producción de quimiocinas y activación del inflamasoma. El modelado de la red reguladora transcripcional apoya la diafonía bidireccional entre los efectos del ácido palmítico sobre el metabolismo y sus efectos sobre los procesos inflamatorios. La tibolona no revirtió estos efectos deletéreos inducidos por el ácido palmítico, lo que sugiere que la tibolona puede inducir cambios en diferentes niveles funcionales, como proteínas o metabolitos. Este estudio constituye la primera investigación de los efectos en todo el transcriptoma de los ácidos grasos saturados en los astrocitos humanos y arroja más luz sobre los mecanismos celulares por los cuales los ácidos grasos saturados pueden promover la neurodegeneración.
Actividad mitocondrial en pacientes críticamente enfermos
(Pontificia Universidad Javeriana) Ayala Acosta, Juan Carlos; Morales Alvarez, Ludis Del Rosario; Hospital Universitario de San Ignacio; Enciso Zamora, Cesar Augusto; Mejia Naranjo, Wilson Alfonso; Riaño Forero, Iván
La respuesta inflamatoria sistémica se instaura en respuesta a un estímulo agresor tanto infeccioso como traumático, bajo la percepción celular de señales de peligro. Esta respuesta está compuesta por tres elementos fundamentales, el sistema neurológico, endocrino e inmunológico, dividida en dos respuestas, una innata mediada por células inflamatorias tales como macrófagos, neutrófilos y células dendríticas y una respuesta adaptativa liderada por Linfocitos. Esta respuesta impone al individuo una carga súbita y elevada de demanda energética que busca contener el estímulo agresor y según el caso en favorecer una adecuada cicatrización. Del desarrollo homogéneo de la misma se obtienen adecuados desenlaces, entendidos como una alta tasa de sobrevida y especialmente con una adecuada calidad de vida. Esta situación induce al paciente a una condición crítica, en donde la funcionalidad de la mayoría de los órganos corporales es llevada a su límite, favoreciendo la aparición de Falla Orgánica Mulsistemica. Este fenómeno es responsable de una alta tasa de mortalidad, con cifras cercanas al 30%, en las unidades de cuidado intensivo en Colombia y en el mundo entero. Estas cifras reflejan por qué la enfermedad critica se considera un problema de salud pública, en donde los costos de atención son exageradamente altos y a pesar de los esfuerzos diagnósticos y terapéuticos los desenlaces continúan siendo desfavorables. La investigación científica considera actualmente que el denominador común de este problema a nivel celular es la disfunción mitocondrial. Razón por la cual la mayoría de las investigaciones se centran en intentar determinar su estado en enfermedad crítica e identificar todos los aspectos relacionados que influyan en su funcionalidad. Este trabajo investigativo, evaluó en tiempo real y en vivo, la función mitocondrial en Linfocitos de sangre periférica, en pacientes críticos sometidos a estímulos inflamatorios infecciosos y no infecciosos. Esta medición de la función mitocondrial se centró en tres aspectos claves de su función en la respuesta inflamatoria, como lo es la producción de especies reactivas de oxígeno (mROS), el consumo de oxigeno mitocondrial (mtVO2) y el potencial de membrana (ΔΨM) por citometría de flujo. Estas tres variables citometricas se compararon y relacionaron con variables clínicas rutinarias tales como Lactato sérico, la proteína c reactiva sérica (C-RP) y la saturación venosa de Oxigeno (SvO2). Este es, en nuestro conocimiento, el primer estudio que evalúa en tiempo real y in vivo la función mitocondrial en células inflamatorias de pacientes en cuidado crítico. En esta cohorte de pacientes se encontró que en las primeras 24 horas post injuria la producción de especies reactivas de oxigeno mitocondriales es la característica principal del estrés inflamatorio a nivel celular, teniendo dos funciones principales: Una función de defensa celular y segunda y aun más importante, una función de señalización celular. La producción de mROS se constituye como un marcador inflamatorio agudo, con una relación estadísticamente significativa con escalas clínicas de falla orgánica como el SOFA, y con marcadores clínicos rutinarios de inflamación como el Lactato sérico. A partir de los resultados obtenidos, los esfuerzos investigativos futuros deben concentrarse en evaluar en tiempo real y in vivo, cómo se encuentran los factores de regulación mitocondrial en el paciente crítico. Es promisorio evaluar in vivo igualmente, la actividad de Sirtuinas y AMPK en estos pacientes y de esta forma complementar el cuadro de actividad mitocondrial in vivo en pacientes críticos.
Caracterización del microbioma bacteriano presente en placa dental, saliva y tejido tumoral de pacientes con y sin carcinoma escamocelular oral : un estudio integrativo del metagenoma y metatranscriptoma
(Pontificia Universidad Javeriana) Tupaz Erira, Herlinto alveiro; García Robayo, Dabeiba Adriana; Gamboa Jaimes, Fredy Omar; Trespalacios Rangel, Alba Alicia; Vargas Flores, Oscar; Hermida, Maikel; González, Octavio; Montaña Lara, José Salvador
Se ha descrito en la literatura el papel que tienen las bacterias en el desarrollo del carcinoma oral de células escamosas (por sus siglas en ingles OSCC). Sin embargo, la mayoría de los estudios han identificado bacterias con base en la secuenciación del gen ARNr 16S, lo cual ha generado diferencias significativas en diversidad y abundancia de algunos géneros bacterianos. Por lo tanto, existe la necesidad de avanzar en la implementación de nuevas herramientas tecnológicas para estudios metagenómicos complementados con estudios metatranscriptómicos que permitan describir con mayor precisión la composición, interacción y actividad de la comunidad bacteriana en distintos microambientes orales de pacientes con y sin OSCC. Por lo cual, en este estudio se caracterizó y se integró el metagenoma con el transcriptoma bacteriano de placa dental, saliva y tejido tumoral en pacientes con y sin OSCC. Para cumplir con este objetivo, se realizó un estudio descriptivo analítico caso control, en tres fases. 1. Se recolectaron 30 muestras orales previo a la cirugía (10 de tejido tumoral, 10 de saliva y 10 de placa bacteriana) de 10 pacientes diagnosticados de OSCC y 20 muestras orales (10 de saliva y 10 de placa bacteriana) de 10 donantes sanos (controles) que asistieron al servicio odontológico en la facultad de odontología; todos los participantes cumplieron con los criterios de selección y firmaron consentimiento informado. Posteriormente, de cada muestra se realizó extracción de ADN y ARN, se evaluó la cantidad y calidad, y se envió al servicio de secuenciación por tecnología MiSeq y HiSeq Illumina®. Con el fin de obtener lecturas de mayor calidad, se realizó la remoción de secuencias de baja calidad mediante el uso del software Trimmomatic. La calidad de las secuencias fue evaluada mediante el uso del software FastQC. Para el análisis del metagenoma se utilizó la base de datos de kraken que incluye secuencias de bacterias en Refseq y el programa Kraken Aligner V1.0. Se realizaron análisis de componentes principales, binomiales, diversidad alfa y beta, y ANOVA, así como también comparaciones inter e intragrupo, análisis de frecuencia (número de veces que la bacteria ocurre en las muestras estudiadas), promedio, desviación estándar, Chi cuadrado. 2. Se describió el metagenoma bacteriano presente en pacientes con OSCC y controles, se encontró un total de 30 filos (compartidos por ambos grupos), 611 géneros (334 compartidos por ambos grupos, 273 solo en pacientes con OSCC y 4 solo en controles). Además, 1.269 especies (1.231 compartidas por ambos grupos, 17 solo se encuentran en pacientes con OSCC y 21 solo en controles). Los resultados indicaron la presencia de un grupo de especies bacterianas únicamente en pacientes con OSCC (estas bacterias se consideraron asociadas a disbiosis) y otro grupo de especies bacterianas presentes únicamente en personas sanas (estas bacterias se consideraron asociadas a eubiosis); por lo cual un análisis posterior se enfocó en las especies bacterianas que pudieran estar relacionadas con procesos de eubiosis y disbiosis. De un grupo de 45 especies bacterianas fueron identificadas: 20 compatibles con eubiosis en saliva, 14 compatibles eubiosis en placa dental, 5 compatibles con disbiosis en saliva y 6 compatibles con disbiosis en placa dental. Esto permitió proponer a Aerococcus urinae, Brachyspira intermedia, Chromobacterium violaceum, Enterobacter asburiae, Lactobacillus helveticus, Mycobacterium chubuense, Mycoplasma penetrans, Streptococcus infantarius, y Streptococcus pasteurianus como las especies de bacterias asociadas a estados de eubiosis; y a Legionella pneumophila, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis Capnocytophaga canimorsus, Mycoplasma conjunctivae y Providencia stuartii, como bacterias asociadas a estados de dibiosis. 3. Para el estudio del transcriptoma se realizaron análisis de calidad y selección de secuencias mediante el uso de herramientas bioinformáticas como Trimmomatic y FastQC, SortmRNA, Trinity. Para la identificación de los transcritos y clasificación taxonómica se utilizó Kraken Aligner V1.0 y PATRIC, bases de datos como CARD, Drug Bank, VICTORS, TCBD y TTD. Se realizó un análisis de carga funcional mediante el estudio de perfiles de expresión de los transcriptomas en 40 especies bacterianas en total, 30 especies compatibles con eubiosis y 10 especies compatibles con disbiosis; 5 especies bacterianas fueron excluidas debido a que no se encontraron los genomas completos. Se evaluaron procesos biológicos relacionados con procesamiento de ADN, ARN y proteínas, metabolismo, respiración, fermentación, energía, ciclo celular, división y muerte. Adicionalmente se estudiaron vías de señalización y genes relacionados con respuesta al estrés, defensa y virulencia, resistencia a antibióticos y compuestos tóxicos. Los resultados relacionados con sistemas biológicos mostraron diferencias significativas entre los dos grupos de bacterias únicamente en biogénesis de ribosomas (p=0,005), mientras que, en los sistemas relacionados con procesamiento y síntesis de proteínas, respuesta al estrés, defensa y virulencia, resistencia a antibióticos y compuestos tóxicos, y metabolismo no se encontraron diferencias significativas (p>0,005). En relación con las vías se señalización de mayor actividad, en el grupo de bacterias asociadas a estados de eubiosis se encontró que fueron: metabolismo de carbohidratos, nucleótidos, aminoácidos y energía; mientras que en el grupo relacionado con estado de disbiosis fueron metabolismo de nucleótidos, aminoácidos, carbohidratos y energía. Al evaluar la expresión de genes relacionados con las vías anteriormente descritas, el grupo de bacterias asociadas a estados de eubiosis expresaron 169 genes en total, cuya función está relacionada con resistencia a antibióticos, factores de virulencia, blancos de medicamentos y transporte. Por su parte, el grupo de bacterias asociadas a estados de disbiosis expresaron 76 genes en total relacionados con resistencia a antibióticos, factores de virulencia y blancos de medicamentos.
Caracterización genética de la anemia de Fanconi en población colombiana, relación con el fenotipo clínico y citogenético
(Pontificia Universidad Javeriana) Moreno Niño, Olga María; Benítez Ortiz, Francisco Javier; Surrallés Callonge, Jordi; Instituto de Genética Humana -Pontificia Universidad Javeriana; Vélez Varela, Patricia; Zarante Montoya, Ignacio Manuel; Briceño Balcazar, Ignacio; Trujillo Quintero, Juan Pablo; Urioste, Miguel
Anemia de Fanconi (AF) es causada por defectos en genes que participan en una ruta de reparación del genoma y en la regulación de procesos en el ciclo celular, de esta manera, diferentes aspectos del desarrollo y la sobrevida del individuo resultan afectados. AF es altamente heterogénea con fenotipos severos hasta fenotipos leves o ausentes que dificultan su diagnóstico. Característicamente los afectados presentan malformaciones congénitas, aplasia medular, predisposición a cáncer, e inestabilidad cromosómica. Debido al desconocimiento de la etiología de AF en Colombia, se propuso caracterizar individuos afectados por AF, identificados de pacientes con diagnóstico o sospecha clínica de la enfermedad. Se reclutaron 157 individuos con diagnóstico o sospecha clínica de AF, 19 con asociación VACTERL, 15 hermanos de casos AF y 34 individuos sanos. Se registraron las características clínicas y se aplicaron las pruebas citogenéticas de hipersensibilidad a diepoxibutano. La caracterización molecular de los casos hipersensibles (AF) fue realizada por MLPA para FANCA, NGS para panel de genes FANC y secuenciación Sanger. 43 casos fueron clasificados AF por prueba citogenética y en 24 se determinó el genotipo. 22(91.6%) tuvieron alteraciones en FANCA, 1(4.2%) en FANCB y 1(4.2%) en FANCD2. Las variantes identificadas fueron deleciones grandes, y mutaciones tipo INDEL y de cambio de base. 10(47.6%) variantes fueron nuevas. Las alteraciones clínicas más comunes fueron hematológicas, esqueléticas, cutáneas, faciales, y de talla. Este estudio informa por primera vez en Colombia sobre las características genéticas de la enfermedad confirmándose una prevalencia elevada de alteraciones en FANCA (91.6%), mayor al promedio informado para otras poblaciones. La mayoría de variantes fueron únicas, aunque se destaca una variante FANCA identificada en varios casos con procedencia regional común.
Análisis genómico comparativo de aislamientos colombianos de helicobacter pylori : viruloma, resistoma, filogenia e identificación de profagos
(Pontificia Universidad Javeriana) Muñoz Delgado, Angela Bibiana; Trespalacios Rangel, Alba Alicia; Vale, Filipa; Alarcón Cavero, Teresa; Torres, Javier; Zabaleta, Jovanny; Bravo, María Mercedes; Piuri, Mariana
Helicobacter pylori es una bacteria patógena capaz de infectar el estómago humano. Se considera la infección bacteriana crónica más frecuente en todo el mundo. Todos los individuos infectados con H. pylori presentan gastritis crónica, y el 20% pueden progresar a enfermedades como úlcera péptica, adenocarcinoma o linfoma gástrico tipo MALT. Numerosos factores se han descrito como responsables de la progresión de la infección, dentro de ellos, varios factores de virulencia de H. pylori. Un desafío crítico que presenta la infección por H. pylori, son los altos niveles de resistencia a los antibióticos. Se han informado tasas de efectividad del tratamiento antibiótico tan bajas como del 57%, cuando la mínima aceptable para un tratamiento empírico es del 90%. Además de ser una bacteria virulenta y resistente a los antibióticos, H. pylori es una bacteria genéticamente diversa. Fenómeno que puede estar influenciado entre otras causas, por la presencia de elementos genómicos móviles, como los profagos. Esta diversidad bacteriana se ha asociado con el origen geográfico de las poblaciones y cuando se ha analizado en conjunto con la diversidad de los profagos, la mayoría de las observaciones indican una concordancia filogeográfica; sin embargo, algunos profagos de H. pylori se han asignado a poblaciones distintas de su anfitrión, mientras que otros han exhibido signos de recombinación entre poblaciones. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de este trabajo fue caracterizar molecularmente genomas colombianos de H. pylori, incluyendo filogenia, resistoma, viruloma y caracterización de profagos. Para ello, se analizaron 221 genomas colombianos de H. pylori, los cuales incluyeron 29 genomas secuenciados en este estudio y 192 genomas recolectados de bases de datos públicas. Para la determinación del viruloma, se realizó la caracterización de los principales factores de virulencia de H. pylori: cagA (motivos EPIYA), cagPAI, vacA (regiones m, s e i), iceA, babA y genes de adherencia. Para conocer el resistoma, se realizó la búsqueda de mutaciones en los genes y/o proteínas relacionadas con resistencia a Claritromicina (CLA), Tetraciclina (TET), Levofloxacina (LEV), Amoxicilina (AMX) y Metronidazol (MTZ). Para el análisis de filogenia, se realizó caracterización por MLST (Multi-locus sequence typing) y análisis mediante SNP (polimorfismos de nucleótido simple), adicionalmente se realizó una caracterización del pangenoma colombiano de H. pylori utilizando el software Roary. La búsqueda y caracterización de profagos, se realizó utilizando los genes marcadores integrasa y holin, así como de la secuencia completa de los profagos. Se realizó una caracterización genómica y filogenética de los profagos colombianos de H. pylori. El análisis de los genomas mostró que estos provenían de aislamientos de H. pylori obtenidos en diferentes regiones de Colombia entre los años 2000 y 2018. Al analizar el viruloma se logró evidenciar que el genotipo de virulencia más frecuentemente encontrado fue vacAs1b i1 m1 / babA2 / iceA2 / cagPAI parcialmente delecionado con cagA+ (EPIYA-ABC), un genotipo definido como de alta virulencia. El análisis de resistoma permitió evidenciar la presencia de mutaciones asociadas a resistencia a CLA en el 3,6% de los genomas analizados, a TET en el 3,61%, a AMX en el 7,23%, a LEV en el 10,26% y a MTZ en el 75,7%. Se encontraron 32 (14,4%) genomas con mutaciones ligadas a resistencia frente a más de un antibiótico. Estos análisis reflejan las características de virulencia y las mutaciones asociadas a resistencia de las cepas que han circulado en el país a lo largo de las dos últimas décadas. El estudio de la estructura poblacional revelo la presencia de un grupo clonal compuesto exclusivamente por aislamientos colombianos. El análisis de pangenoma permitió evidenciar que el pangenoma colombiano de H. pylori es abierto y muy diverso, lo cual está relacionado con la amplia diversidad genética y la historia evolutiva de esta bacteria humana. Los análisis de búsqueda y caracterización de profagos permitieron encontrar profagos o parte de ellos en 11 de los genomas analizados, incluyendo los genomas secuenciados en este estudio y los colombianos disponibles en bases de datos públicas. Los análisis de filogenia para estos profagos mostraron evidencia de una nueva población filogenética formada exclusivamente por profagos de origen colombiano. Este nuevo grupo clonal fue denominado hpColombia. Los resultados obtenidos aquí permiten ampliar el conocimiento de la genómica de aislamientos colombianos de H. pylori, dar a conocer la presencia de profagos en éstos, comprobar la presencia de un grupo clonal específico para los profagos colombianos de H. pylori y también para sus bacterias hospederas. Adicionalmente, los análisis realizados aquí permiten verificar que la genómica comparativa es una herramienta útil en la evaluación de varios elementos que contribuyen a la diversidad entre los genomas de H. pylori.
Identificación del perfil mutacional en los genes BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cancer de mama y de ovario familiar en población Afrocolombiana
(Pontificia Universidad Javeriana) Vargas Castellanos, Elizabeth; Torres López, Diana María; Villegas, Victoria; Perdomo, Sandra; Forero, Maribel; Cruz, Paola; Ossa, Carlos Andres; Rangel Jimenez, Nelsón Enrique
El cáncer de mama es un problema de salud pública a nivel mundial, además de ser el cáncer más frecuente en población colombiana, con tasas de incidencia y mortalidad, para el 2020 de 25.7% (15.509 nuevos casos) y de 15.7% (4.411) de muertes en mujeres por esta enfermedad. Aproximadamente entre 5%-10% de todos los canceres de mama en mujeres están asociados con susceptibilidad heredada debido a los dos genes más importantes que son BRCA1 y BRCA2. La contribución de estos dos genes al cáncer de mama o de ovario hereditario en población colombiana ha sido evaluada mediante dos estudios preliminares realizados en población blanca/mestiza. Las diferencias en la frecuencia y el espectro de las mutaciones en los genes BRCA1/2 muestran una variación considerable entre los grupos étnicos. Sin embargo, sólo se dispone de datos limitados sobre la contribución de las mutaciones en los genes BRCA1/2 en el cáncer de mama/ovario hereditario en población africana y actualmente no hay información sobre la población afrocolombiana. Por lo tanto, es necesario investigaciones adicionales sobre los factores genéticos que contribuyen al cáncer de mama y/o ovario en las familias colombianas de ascendencia africana, lo que permitirá la detección de mutaciones para guiar la prevención y la terapia, considerando que Colombia es el segundo país con mayor diversidad étnica en las Américas, después de Brasil. Por tal motivo, este proyecto de investigación se constituye en el primer estudio de mutaciones en los genes BRCA1/2 en población Afrocolombiana, el cual permitirá determinar las bases moleculares del cáncer de mama y de ovario hereditario para este grupo poblacional. El análisis de las regiones codificantes de los genes BRCA1/2 en las 60 familias Afrocolombianas con cáncer de mama y de ovario, se realizó mediante secuenciación de siguiente generación (NGS) para la identificación de mutaciones de pequeño rango y amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples para la identificación de grandes re-arreglos genómicos. En total se identificaron cinco mutaciones patogénicas de línea germinal, incluida una nueva mutación, que comprende cuatro en el gen BRCA1 y una en el gen BRCA2. La prevalencia de mutaciones fue del 3.9% (2/51) en las familias afectadas por el cáncer de mama y del 33.3% (3/9) en familias afectadas por cáncer de mama y de ovario. El análisis de haplotipo de dos portadores de la mutación BRCA2_c.2701delC (un paciente con cáncer de mama afrocolombiano y uno previamente identificado blanco/mestizo colombiano) sugiere un ancestro común. Nuestros datos mostraron que 2/5 (40%) mutaciones son compartidas por poblaciones blancas/mestizas colombianas y afrocolombianas. Estos resultados proponen que estas dos poblaciones están estrechamente relacionadas. Sin embargo, se observaron variaciones en el espectro mutacional BRCA1/2 entre subgrupos afrocolombianos de diferentes regiones del país, lo que sugiere que es necesario desarrollar estrategias específicas de evaluación de riesgos genéticos entre diferentes grupos étnicos de Colombia.
Análisis bioquímico y transcriptómico de eritrocitos expuestos in vitro a metilmercurio en la tortuga marina Caretta caretta
(Pontificia Universidad Javeriana) Hernández Fernández, Javier Adolfo; López Barrera, Ellie Anne; Pinzón Velasco, Mauricio Andres; Mariño Ramirez, Leonardo; Moncaleano Niño, Angela Margarita; Romero Garcia, Diego; Rodríguez Rojas, Luis Miguel; Jordan, Irving King; Carreras Huergo, Carlos
El metilmercurio (MeHg) es la forma más tóxica y abundante del mercurio en la red alimentaria marina, produciendo daños sobre la salud a diferentes niveles en los organismos vivos y humanos. Las tortugas cabezonas (Caretta caretta) son consideradas especies centinelas de contaminación ambiental debido a su susceptibilidad, a la acumulación de xenobióticos como consecuencia de su longevidad, baja tasa metabólica y su conversión eficiente de presas en biomasa. En un esfuerzo por entender los cambios en las actividades de las enzimas y la expresión de genes como biomarcadores de exposición a MeHg, nosotros expusimos eritrocitos de tortugas cabezonas a diferentes concentraciones de MeHg bajo condiciones controladas de laboratorio. Se determinó la CL50 de eritrocitos (eritrocitos) a MeHg y se evaluó el estrés oxidativo producido por MeHg en eritrocitos de cinco tortugas cabezonas pre-juveniles sometidas a concentraciones agudas de 0, 1 y 5 mg L-1, incubados in vitro a 30ºC por 12 h de exposición. Se evaluó la viabilidad de los eritrocitos a las 12 h y se analizó la actividad de las enzimas superóxido dismutasa (SOD), glutatión S-transferasa (GST) y la peroxidación lipídica por malondialdehído (MDA) a las 6 y 12 h de exposición. La concentración de Hg-T en agua fue de 1,96 µg L-1 y en eritrocitos de tortugas en cautiverio fue en promedio 31,14 µg L-1. Los eritrocitos expuestos en todas las concentraciones de MeHg mostraron aproximadamente 100% de viabilidad celular. Los niveles de MDA a las 6 y 12 h de exposición fueron más altos en los eritrocitos tratados con 1 y 5 mg L-1 de MeHg respecto al control. La actividad GST se inhibió a las 12 h de exposición al aumentar la concentración de Hg. La actividad SOD presentó variaciones en cada uno de los tratamientos, a las 6 h fue mayor a 1 mg L-1 y a las 12 h, fue ligeramente mayor a 5 mg L-1. No se observaron diferencias significativas en las actividades SOD, GST y MDA entre los tratamientos a las 6 y 12 h (Kruskal Wallis, p < 0,05). Sin embargo, se observó una correlación positiva entre la concentración de MeHg y los niveles de MDA (r = 0,56, p< 0,05) a las 12 h de exposición (Sperman). Esta fase de la investigación mostró a los eritrocitos como un buen modelo para estudios ecotoxicológicos. Preliminarmente, el transcriptoma sanguíneo de la tortuga cabezona fue secuenciado por RNA-seq. Este estudio proporciona el primer transcriptoma sanguíneo de alta calidad y el primer análisis estructural y funcional de tioredoxinas (Tnxs) y peroxiredoxinas (Prdxs) de la tortuga cabezona. El transcriptoma estuvo compuesto por 515.597 contigs con un N50 de 2631 pb. Se obtuvieron 374.545 unigenes, de los cuales 165.676 tenían ORF que codifican proteínas putativas. Un total de 52.147 (31,5%) de estas transcripciones tenían coincidencias de homología significativas en al menos una de las cinco bases de datos utilizadas. El estudio resultó en la identificación de 180 proteínas con actividad antioxidante, incluidas 28 Prdxs y 50 Tnxs. En general, los sitios activos y los motivos estructurales de las Prdxs y Tnxs estaban conservados. La investigación de Prdxs y Txns es de suma importancia debido a su abundancia y alta eficiencia catalítica en la reducción de peróxidos. Para profundizar en la expresión diferencial de genes y estudiar vías metabólicas afectadas por MeHg, se aisló el RNA total de cada una de las muestras de eritrocitos sometidos a MeHg (5 x 1 mg L-1 y 5 x 5 mg L-1) y los controles (5 x 0 mg L-1). Se obtuvo por RNA-seq el transcriptoma de los eritrocitos de la tortuga cabezona utilizando BGISEQ (lecturas pareadas de 100 pb). Nosotros generamos, entre todos los tratamientos 130.98 Gb en total (1333 millones de lecturas), y con estas, se ensambló un transcriptoma de novo. Las lecturas de secuencia de cada uno de los tratamientos (0, 1 y 5 mg L-1) se utilizaron para realizar análisis de expresión diferencial de genes y metabolismo de selenocompuestos, cisteína y metionina, glutatión y peroxiredoxinas. El análisis de expresión por RNA-seq identificó 83 genes desregulados, 39 sobreexpresados y 44 reprimidos. Los resultados indican claramente que el MeHg alteró los patrones de expresión génica como respuesta al estrés celular producido, reflejado en la desregulación del ciclo celular, la actividad lisosomal, la autofagia, la regulación del calcio, regulación mitocondrial, apoptosis y regulación de la transcripción y traducción. De acuerdo con el análisis de DEGs realizados se reporta una respuesta baja de la maquinaria antioxidante de reacción temprana ante la toxicidad del MeHg, evidenciado porque estos genes no se desregularon. Al parecer, los eritrocitos de la tortuga cabezona mantienen una expresión constitutiva de genes que representan buena parte de la defensa contra las especies reactivas de oxígeno (EROS) inducidas por el MeHg. Esta investigación representa el primer estudio realizado sobre la respuesta de eritrocitos a concentraciones agudas de MeHg en tortugas cabezonas utilizando RNA-seq. Los genes expresados diferencialmente identificados en este estudio proporcionan una línea base para estudios posteriores sobre los impactos del estrés oxidativo del MeHg en eritrocitos de la tortuga cabezona.
Análisis transcriptómico de los mecanismos moleculares de lignificación y estrés hídrico en melina (Gmelina arborea Roxb)
(Pontificia Universidad Javeriana) Yaya Lancheros, Mary Luz; Terán Pérez, Wilson; Mejía Guerra, María Katherine; Mendu, Venugopal; Caro Quintero, Alejandro; Quimbaya Gómez, Mauricio; Carrer, Helaine
Gmelina arborea es una especie de importancia comercial. En Colombia, las plantaciones se encuentran principalmente en la región caribe, zona caracterizada por la presencia de dos periodos de sequía al año. Para ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de respuesta a estrés hídrico en melina, se realizó un análisis de expresión diferencial a partir de datos previamente obtenidos para la especie. Se evaluaron cuatro métodos de ensamble de novo; una estrategia de metaensamble fue seleccionada como la más adecuada. El transcriptoma fue anotado y se identificaron marcadores SSRs con predominancia de las repeticiones de dinucleótidos AT y AG. Los análisis de expresión diferencial entre raíces estresadas y no estresadas, indicaron activación de genes de las vías dependientes e independientes de ABA. Algunos genes pertenecían a la vía de los monolignoles lo que evidencia cambios en la formación de lignina bajo condiciones de estrés. La lignificación está relacionada con procesos de formación de madera y con mecanismos de respuesta a estrés. Con el fin de obtener conocimiento relacionado con los genes involucrados en biosíntesis y regulación de las vías de lignificación en melina, se empleó una aproximación de RNA-seq. El ARN proveniente de árboles jóvenes fue secuenciado y las lecturas fueron ensambladas en 110.992 transcritos. Se anotaron 49.364 transcritos correspondientes a 5071 categorías ontológicas y 10.256 transcritos fueron asignados a 130 vías metabólicas KEGG. Se identificaron 20954 genes diferencialmente expresados entre hoja y tallo, de los cuales se validaron siete por qRT-PCR. Adicionalmente se analizó el perfil de ARNs pequeños expresados en xilema secundario.
Recovery dynamics of carabid beetles (Coleoptera, Carabidae) in colombian tropical dry forest
(Pontificia Universidad Javeriana) Ariza Lozano, Gloria Maria; Jácome Reyes, Jorge Hernán; Kotze, Johan David; Favila Castillo, Mario Enrique; Amezquita Melo, Sandra Jimena; Noriega Alvarado, Jorge Ari; Roa Fuentes, Lilia Lisseth; Urbina Cardona, Jose Nicolas
In this work, I characterized the dynamics of carabid beetles along an environmental gradient formed by successional processes and a marked dry season in three different habitat types (pasture as initial point, early successional stage, and forest as intermediate successional stage) in a Colombian tropical dry forest landscape. In the first chapter, background context is provided and the scope of the thesis is established. In chapter 2, I analyzed the suitability of morphological traits to infer not only functional response traits but also the adaptability of carabid beetles to the harsh TDF environment exasperate by the El Niño/Southern Oscillation (ENSO). I also compared qualitative and quantitative variables among the El Niño and non-El Niño events to observe possible carabid beetle changes as a result of environmental variability. In chapter 3, I evaluated the response of carabid beetles (both at the assemblage and individual species levels) along TDF succession and dry and wet periods, which was exasperated by the El Niño/Southern Oscillation (ENSO). To better understand these responses, I related environmental variables (soil and air humidity and temperature, leaf litter depth and canopy cover) to the beetle assemblage to identify drivers of successional dynamics. Similarly, and with the goal to have a better understanding of the successional dynamics of these organisms, I explored in chapter 4 the functional response of carabid beetles to succession. I identified ecological groups present in different successional habitat types in TDF, and environmental variables related to each trait. In chapter 5, I present a list of TDF carabid species collected from the Valley of Magdalena River (Colombia), and ecological information associated with these species inferred from morphological traits, in an attempt to offer a starting point for future studies on this taxonomic group. Finally, in chapter 6, I provide a general overview of my thesis to synthesize the findings and propose general patterns of the dynamics of carabid beetles in the TDF successional environment.
Estudio proteómico y efecto de la modulación de la vía Calmodulina/Calcineurina en aislamientos de Candida glabrata resistentes a caspofungina
(Pontificia Universidad Javeriana) Ceballos Garzón, Carlos Andrés; Parra Giraldo, Claudia Marcela; Le Pape, Patrice; Pontificia Universidad Javeriana; Universite de Nantes; Marchand, Pascal; Alonso Monge, Rebeca; Muñoz Henao, Julian Esteban; Gonzalez Marin, Angel; Alvarez Rueda, Nidia
A pesar de la prevalencia de las infecciones fúngicas, el número de antifúngicos es reducido y la aparición de resistencia es creciente. El principal desafío terapéutico radica en lograr la selectividad fúngica. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos antifúngicos con diferentes mecanismos de acción y desarrollar fármacos que mejoren la actividad de los antifúngicos actuales. En este trabajo, el primer objetivo se basó en la identificación de mecanismos de resistencia a candinas mediante la secuenciación del genoma completo en aislamientos clínicos de C. glabrata. Luego, se realizaron estudios proteómicos de la respuesta de crecimiento frete a la exposición a caspofungina, seguido del análisis del impacto de inhibidores y mutantes de la vía calcineurina en la susceptibilidad, tolerancia a estrés, formación de biopelículas y patogenicidad en Galleria mellonella. Después de evaluar los genes relacionados con el crecimiento antifúngico, encontramos que las cepas solo presentaron mutación en el gen FKS2. Para descifrar el perfil proteómico de C. glabrata en respuesta a la exposición a caspofungina, se realizó extracción e identificación de proteínas. Identificamos 21 proteínas cuya abundancia cambió, algunas de las proteínas están involucradas en la biosíntesis de la pared celular, patogénesis y respuesta al estrés. Además, algunas de estas son miembros de la vía CaM/Cal, como el factor transcripcional Crz1. Corroboramos estos resultados utilizando inhibidores de CaM/Cal y mutantes Crz1Δ, en donde logramos retornar el fenotipo de susceptibilidad y disminuir la capacidad de respuesta a condiciones de estrés y patogenicidad. Los inhibidores de proteínas de la vía CaM/Cal, como el factor de transcripción Crz1 podrían ser una excelente opción terapéutica, basados en los resultados obtenidos y probados en modelos in vitro e in vivo. Resultados, que podrían usarse potencialmente para mejorar las terapias en las infecciones fúngicas, especialmente ahora que la resistencia a los antifúngicos está en aumento.
Desarrollo de un biofertilizante a base de biochar y bacterias fosfato solubilizadoras para el cultivo de Allium cepa L.
(Pontificia Universidad Javeriana) Blanco Vargas, Yully Andrea; Pedroza Rodríguez, Aura Marina; Díaz Ariza, Lucía Ana; Poutou Piñales, Raúl Alberto; Ramos Monroy, Oswaldo Arturo; Dutra Costa, Maurício; Ortega Blu, Rodrígo; Pérez Florez, Alejandro; Quevedo Hidalgo, Balkys Esmeralda
RESUMEN Objetivo. El objetivo general de la tesis fue desarrollar un biofertilizante a base de biochar y bacterias fosfato solubilizadoras para el cultivo de Allium cepa L. Para ello, la investigación se desarrolló en tres fases. Fase I: Se aislaron bacterias fosfato solubilizadoras (BPS) productoras de ácidos orgánicos y fosfatasas a partir de cultivos de Allium cepa L. Se diseñó un medio de cultivo para las bacterias con componentes de origen económico en donde se incluyó la roca fosfórica (RF) como fuente de fosforo. Se realizaron pruebas de estabilidad del bioinoculante. Fase II: Se realizó la caracterización física química y microbiológica del aserrín de pino que sirvió de materia prima para producción de biochar que sirvió como soporte de las BPS del bioinoculante. A partir de la caracterización inicial se seleccionaron las condiciones de producción y las proporciones de aserrín a emplear para la obtención del biochar. La caracterización final del biochar se realizó implementando técnicas como microscopia electrónica de barrido, análisis próximo, composición nutricional, espectroscopia de infrarrojo. Fase III: Se evaluó el efecto benéfico del bioinoculante en Allium cepa L a escala de laboratorio, invernadero y campo durante 5 meses. Se evaluó el efecto del biofertilizante compuesto por el bioinoculante y el biochar en plantas de Allium cepa L., en materas, empleando un diseño de bloques completamente al azar durante 4 meses. Resultado. El biofertilizante demostró efectos benéficos en el cultivo de Allium cepa L. evidenciados en los resultados de las variables de respuestas evaluadas: Altura del bulbo, diámetro del bulbo, peso fresco, peso seco, nutrientes en bulbo, nutrientes en suelo, con respecto a los demás tratamientos. Conclusión. Las BPS evaluadas en este estudio, tienen la capacidad de solubilizar P de RP a través de la producción de ácidos orgánicos, en especial ácido glucónico el cual se produjo en una proporción de 77,6 % de los ácidos producidos. Además, producen enzimas fosfatasas que están implicadas en la mineralización de P orgánico y también pueden estar implicadas en el proceso de germinación de semillas.
Producción a escala piloto (10 L) y caracterización de un concentrado enzimático de rPOXA 1B para la remoción de colorantes
(Pontificia Universidad Javeriana) Ardila-Leal, Leidy Diana; Poutou Piñales, Raúl Alberto; Pedroza Rodriguez, Aura Marina; Quevedo Hidalgo, Balkys Esperanza; Moldes Moreira, Diego; Barrágan Huertas, Blanca Estela; Ramos Monroy, Oswaldo; Loango Chamorro, Nelsy; Mejia Chica, Sol Milena
Introducción. Las lacasas (E.C. 1.10.3.2) son enzimas oxidoreductasas multicobre de gran importancia e interés biotecnológico, debido a su alto potencial oxidativo y a que durante la catálisis generan H₂O en lugar de H2O2. Las lacasas son útiles para remover (a través de la decoloración) colorantes sintéticos, oxidar compuestos fenólicos y degradar pesticidas, entre otros. No obstante, para asumir la producción, comercialización y uso a gran escala de las lacasas, es importante conocer la estabilidad y la vida media de la enzima (t1/2); lo que permitiría proponer condiciones de uso y almacenamiento, ajustadas a las características y origen de cada enzima. Objetivos. Producir a escala de 10 L, la enzima recombinante rPOXA 1B de Pleurotus ostreatus expresada en Pichia pastoris para la remoción de color en agua residual coloreada de laboratorio (CLWW) y conocer la estabilidad a tiempo real y acelerada de la misma. Metodología. Se utilizó la cepa recombinante Pichia pastoris X33/pGAPZaA-LaccPost-Stop (Clon 1) para la expresión de la lacasa POXA 1B (rPOXA 1B) de Pleurotus ostreatus. Se estandarizó la técnica para la detección de la actividad enzimática a través de dos diseños experimentales, un “D-optimal Design” y un “D-optimal Design (irregular)” para identificar las mejores condiciones de deteción en tampón acetato y tampón citrato respectivamente. El complejo enzima-sustrato fue evaluada mediante análisis de acoplamiento molecular empleando Autodock Vina. Luego se llevó a cabo la producción de 3 lotes de rPOXA 1B (L1, L3 y L4) en biorreactor a escala de 10 L con volumen efectivo de trabajo (VET) de 6 L, empleando un medio de cultivo previamente mejorado en nuestro grupo de investigación. Se optimizó (a escala de laboratorio) un medio de cultivo de bajo costo a través de la implementación de tres diseños experimentales; dos “Central Composite Design” (CCD-1 y CCD-2), seguidos de un “One Factor Experimental Design” (OFED). Se demostró (a escala de laboratorio) el efecto de la adición de metanol (CH3OH) después del agotamiento de la glucosa (C6 H12O6) para lo cual se utilizaron cuatro medios de cultivo diferentes con y sin adición de CH3OH. Para los estudios de estabilidad a tiempo real (RTS) con duración de 1 año, se utilizó parte de los concentrados enzimáticos (impuros y sin preservantes) provenientes de los lotes L1, L3 y L4, para lo cual se implementaron cinco temperaturas teóricas, -30, 4, 25, 30, 35 y 40 °C, [243.15, 277.15, 298.15, 303.15, 308.15 y 313.15 K] y utilizando la ecuación de Arrhenius se evaluó la estabilidad acelerada (AS) del concentrado de rPOXA 1B. El RTS fue soportado computacionalmente con estudios de dinámica molecular (MD) a cuatro temperaturas diferentes (-32, 5, 25 y 41°C); [241, 278, 298 y 314 K] muy cercanas a las evaluadas experimentalmente. Otra parte de los concentrados enzimáticos de los lotes L1, L3 y L4 se utilizaron en la remoción de colorantes en aguas residuales coloreadas de laboratorios (CLWW) de prácticas e investigación de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia. Se realizaron tres procesos (P1, P2 y P3) de remoción, empleando CLWW a 1500 unidades de color (UC), en una Planta Piloto de Tratamiento que consta de un tanque de homogeneización, neutralización y mezcla de 20 L, seguido de un biorreactor de aireación prolongada (flujo turbulento y oxígeno de disolución > 1 mgL-1) de 15 L con 10 L de VET, a temperatura ambiente del laboratorio (~19 ± 3 °C) y con un tiempo de retención hidráulica de 72 h, seguido de dos filtros de arena cuarcítica. Durante el curso de la investigación y de acuerdo a la exigencia de cada metodología, se midió: actividad enzimática (UL-1), concentración de proteínas (mg mL-1), concentración de azúcares reductores (gL-1), actividad específica (Umg-1), biomasa (gL-), velocidad específica de crecimiento µx (h-1), tiempo de duplicación td (h), velocidad máxima de reacción Vmax (mM min-1), constante de Michaelis-Menten KM (mM), productividad (UL-1h-1), carbono total (CT) (mgL-1), nitrógeno total (NT) (mgL-1), relación carbono-nitrógeno C/N, constante de desactivación kd (meses-1), vida media t1/2 (meses), energía de desactivación Ed (kJ mol-1), variación de entalpía H* (kJ mol-1), variación en la energía libre de Gibb´s G* (kJ mol-1), variación de entropía S* (J mol-1K-1), carbono inorgánico (CI) (mgL-1), carbono orgánico total (COT) (mgL-1), demanda química de oxígeno (DQO) (mgL-1), demanda biológica de oxígeno a los 5 días DBO5 (mg L-1), relación COT/NT, relación DQO/COT, pH, unidades de color UC e índice de germinación IG (%). Resultados. El uso de tampón citrato incrementó la afinidad de rPOXA 1B por el sutrato (ABTS) con una KM inferior a la del tampón acetato; las condiciones estandarizadas fueron pH 3.0 ± 0.2; λ420 nm, 2 mM ABTS y los análisis de acoplamiento molecular obtuvo un complejo de unión enzima sustrato con una energía libre de unión de -6.4 KJ mol-1. En biorreactor de 10 L con el medio previamente mejorado se obtuvo 8,506.95 ± 1,993.65 UL-1 con actividad específica de 213.64 ± 55.83 Umg-1 a las 192 h de cultivo, usando tampón citrato. Después de la optimización estadística secuencial se obtuvo un medio (20 gL-1 glucosa USP, 50 g L-1 proteína de soya aislada 90 % (p/p), 11.74 g L-1 extracto de malta, 4.91 gL-1 (NH4)2SO4, 0.16 gL-1 CuSO4 y 0.1 gL-1 cloranfenicol) 89.84 % menos costoso, con una actividad enzimática de 12,877.3 ± 481.2 UL-1 y actividad específica de 1324.58 ± 114.19 U mg-1 en 168 h, lo que significó un incremento en la actividad enzimática del 33.94 % con relación a los resultados en biorreactor de 10 L con medio mejorado. La adición de metanol después del agotamiento de la glucosa tuvo un efecto positivo sobre la actividad enzimática y se obtuvo 14,868.06 ± 461.58 U L-1 con actividad específica de 1597.6 ± 76.28 U mg-1 en 192 h utilizando el medio optimizado de bajo costo, para un incremento de 41 % de la actividad enzimática en comparación con el mismo medio sin adición de metanol. En el RTS se recuperó 101.16, 115.81, 75.23, 46.09, 5.81 y 4.83 % de la actividad enzimática relativa, a las diferentes temperaturas ensayadas. Los estudios de AS mostraron que el concentrado de rPOXA 1B se puede conservar a 240.98  5.38, 277.40  1.32 o 297.53  3.88 K con t1/2 de 230.8, 46.2 y 12.6 meses, respectivamente. Los parámetros cinéticos y termodinámicos respaldaron la alta estabilidad de rPOXA 1B con bajas variaciones de KM y Vmax a temperaturas de 240.98  5.38 y 297.53  3.88 K, Ed de 41.40 KJ mol-1 y valores apropiados de ∆H, ∆G y ∆S. La MD mostró que las fluctuaciones en la estructura 3D de POXA 1B, específicamente en regiones bucle, coils or loops con aminoácidos hidrofílicos o de polaridad intermedia, así como en algunos residuos, se incrementa con el aumento de la temperatura; pasando de 3 residuos fluctuantes (LEU159, ALA391 y ASP429) a 278 K a 6 residuos (THR160, ASP266, GLU293, ALA334, ASP341 y LEU459) a 298 K y a 9 residuos (ASP101, THR160, GLY265, ASN297, ALA334, GLY370, ALA391, PRO393 y ASP433) a 314 K. La remoción de color promedio del CLWW (1500 UC) fue de 96.75 % y se logró la reducción de los parámetros de descarga TOC, TC, DQO y DBO5. Conclusiones. Con el medio optimizado se aumentó la actividad enzimática 33 % con relación al medio previamente mejorado. Se demostró el efecto positivo de añadir CH3OH al cultivo, después del agotamiento de la glucosa, lo que generó un incremento de 41 % en comparación con el medio sin metanol. Es importante destacar que la adición de metanol no es una opción amigable con el medio ambiente, ya que el concentrado enzimático se utiliza impuro y podría contener trazas de metanol, pero resulta de utilidad si se requiere la producción de la enzima pura para usos no ambientales, además, de que rompe con el hábito de utilizar estrictamente glucosa para la expresión de proteínas recombinantes bajo el control del promotor pGAP, como sucede con la mayoría de los trabajos publicados. La lacasa rPOXA 1B es una enzima estable, lo cual fue demostrado experimental y computacionalmente con t1/2 de 230.8, 46.2 ó 12.6 meses, si es conservada impura y sin preservantes a temperaturas de 240.98  5.38, 277.40  1.32 o 297.53  3.88 K respectivamente, lo cual tiene gran utilidad para los grandes productores. El tratamiento secundario de CLWW (1500 UC) con el concentrado de rPOXA 1B generó una remoción de color promedio de 96 % en 72 h de tratamiento con disminución de los parámetros de vertimiento.
Estudio de la transformación de TNT, 2,4-DNT y PETN por bacterias aisladas de ambientes impactados con explosivos
(Pontificia Universidad Javeriana) Avellaneda Avendaño, Hernán Darío; Roldan Garcia, Fabio Augusto; Arbeli, Ziv; de Lorenzo, Victor; Durante Rodriguez, Gonzalo; Junca, Howard; Husserl, Johanna; Alméciga Díaz, Carlos Javier
El 2,4,6-trinitrotolueno (TNT), el pentaeritritol tetranitrato (PETN) y el 2,4-dinitrotolueno (2,4-DNT) son compuestos tóxicos ampliamente usados en la industria, y que comúnmente coexisten en ambientes impactados con explosivos. El tratamiento biológico de estos ambientes cuenta con limitantes, como son la necesidad de una fuente de carbono para la transformación de TNT y PETN y la inhibición que causa el TNT en las rutas metabólicas de otros compuestos. Teniendo esto en cuenta, en este trabajo se tuvo como objetivo estudiar la transformación de TNT, PETN y 2,4-DNT en cepas bacterianas, y evaluar el efecto del TNT en la transformación de los otros dos compuestos. Para esto, se evaluaron las cepas Raoultella planticola M30b y Rhizobium radiobacter M109c aisladas previamente en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) y Cupriavidus metallidurans DNT suministrada por el Dr. Jim Spain (Georgia Tech, Atlanta). Las tres cepas fueron capaces de transformar TNT y PETN como única fuente de nitrógeno y 2,4-DNT como única fuente de carbono y nitrógeno. Interesantemente, en R. radiobacter M109c y C. metallidurans DNT el TNT afectó negativamente, pero no inhibió completamente, la transformación de 2,4-DNT, mientras que en R. planticola M30b, el TNT inhibió completamente la transformación de 2,4-DNT. Por otro lado, en las tres cepas el TNT disminuyó la transformación del PETN, pero sin inhibirla completamente. Con el fin de determinar los genes posiblemente implicados en la transformación del TNT, PETN y 2,4-DNT, se realizó la secuenciación del genoma completo de las cepas R. planticola M30b y R. radiobacter M109c y adicionalmente se realizaron librerías de clones a partir del ADN de ambas cepas. En ninguna de las cepas se detectaron los genes codificantes para la DNT dioxigenasa, reportada en la mineralización del 2,4-DNT, lo cual sugiere que estas cepas poseen enzimas aun no reportadas para este proceso. En R. planticola M30b, la secuencia 4471 es el candidato más fuerte para llevar a cabo la función de la DNT dioxigenasa ya que comparte el dominio catalítico Rieske 2Fe-2S hierro-azufre y a que está relacionada filogenéticamente con enzimas con actividad frente a compuestos con características químicas similares a las del 2,4-DNT. En cuanto a la cepa R. radiobacter M109c, la secuencia 1728 es la única que posee el dominio, Rieske 2Fe-2S hierro-azufre, lo cual sugiere que puede estar relacionada en la transformación del 2,4-DNT. Por otro lado, R. planticola M30b posee una enzima similar a la PETN reductasa, mientras que R. radiobacter M109c posee una enzima similar a la GTN reductasa y 3 enzimas similares a la nitroreductasa PnrA. La PETN reductasa ha sido reportada en la transformación tanto del TNT como del PETN, mientras que la GTN reductasa y la nitroreductasa PnrA han sido reportadas en la transformación del PETN y el TNT respectivamente. Nuestros hallazgos indican que los cultivos de enriquecimiento con TNT pueden ser usados para aislar bacterias transformadoras de 2,4-DNT y PETN, de hecho, este es el primer reporte de bacterias transformadoras de 2,4-DNT aisladas de cultivos de enriquecimiento con TNT. La cepa R. radiobacter M109c puede ser usada para remediar sitios contaminados con mezclas de TNT, 2,4-DNT y PENT, debido a su capacidad para transformar los tres compuestos. Finalmente, se identificaron genes en las cepas R. planticola M30b y R. radiobacter M109c que están posiblemente relacionados con la transformación del TNT, PETN y 2,4-DNT y a la tolerancia frente estos compuestos.
Erradicación de helicobacter pylori : una propuesta desde la farmacogenética y la epigenética en una población de Bogotá
(Pontificia Universidad Javeriana) Arévalo Galvis, Azucena; Trespalacios Rangel, Alaba Alicia; Pontificia Universidad Javeriana; Alarcón, Teresa; Pérez Pérez, Guillermo Ignacio; Zabaleta, Jovanny; López Segura, Valeriano; Corredor, Mauricio
Antecedentes: Helicobacter pylori (H. pylori), es la principal causa de gastritis crónica, ulceras pépticas, linfoma MALT gástrico y cáncer gástrico (GC) (1). Consensos internacionales recomiendan erradicar la infeción (2-6). Sin embargo, la eficacia de las terapias triples de primera línea es inferior al 80%. En Colombia Trespalacios et al. 2011 reportaron que la eficacia de la terapia triple estándar (Inhibidor de bomba de protones (IBP) + amoxicilina + claritromicina) es 71% y la triple terapia con levofloxacina es 75% (7). La principal causa de fracasos terapéuticos es la resistencia bacteriana (8). No obstante, en Colombia 12.5% de los tratamientos fallan aun en ausencia de resistencia bacteriana (7). Una explicación a esto, es la falta de eficacia de los IBPs para bloquear la producción de ácido gástrico, ya que la farmacocinética de los IBPs se ve afectada por factores farmacogenéticos del individuo como la presencia de polimorfismos en la enzima del sistema citocromo P450 (CYP) 2C19, encarcada de metabolizar los IBPs (lansoprazol, pantoprazol y omeprazol) (9,10,11). Dependiendo del polimorfismo los individuos metabolizaran rápida o lentemente los IBPs, de tal manera que la capacidad de inhibición del ácido será diferente en cada individuo (12). Los IBPs son fundamentales en las terapias de erradicación ya que al elevar el pH gástrico aumentan la eficacia de los antibióticos sensibles al ácido como claritromicina y amoxicilina (12) por esto, conocer la distribución de estos polimorfismos permitiria personalizar las terapias. La erradicación exitosa de H. pylori tiene muchos beneficios (13-17) particularmente en lugares con alta incidencia de cáncer gástrico (18). En Colombia la incidencia de CG para el año 2018 fue de 7419 casos, siendo el tercer cancer más prevalente en nuestro pais (19), y sin las medidas de prevención efectivas su incidencia permanecería estable o incluso podría aumentar para el 2030 (18), por lo que, lograr una terapia de erradicación eficaz a largo plazo impactaría en su prevención (20). Sin embargo, erradicar la infección no garantiza que la mucosa gástrica se restablese en su totalidad ya que se ha documentado “un punto de no retorno” (17), probablemente relacionado con alteraciones genéticas y epigeneticas que H. pylori induce sobre la célula epitelial gástrica desde el inicio de la infección y se acumulan a lo largo del proceso infeccioso (21, 22). El evento epigenético más temprano que ocurre en gastritis crónica es la hipermetilación aberrante en genes supresores de tumor que codifican para cadherina (CDH1) y inhibidor 2A de quinasa dependiente de ciclina, (CDKN2A), cuyas metilaciones conducen a la reducción de su expresión y posterior disfunsión en la unión célula a célula y del ciclo celular (15). Estos cambios epigeneticos son potencialmente reversibles por lo que la erradicación exitosa del microorganismo podría revertir este proceso (15), sin embargo, actualemente en el mundo esto continua siendo motivo de estudio. Objetivo: Determinar la influencia de los polimorfismos genéticos de CYP2C19 en la erradicación de H. pylori y de manera prospectiva en ausencia de resistencia bacteriana, determinar si al erradicar la infección se elimina o disminuye la metilación de los genes CDH1 y CDKN2A, los cuales se consideran cambios epigenéticos fundamentales en la carcinogénesis gástrica durante la infección por H. pylori. Metodología: La influencia de los polimorfismos de CYP2C19 en la erradicación de H. pylori se evaluó mediante un experimento clínico aleatorizado doble ciego (ClinicalTrials.gov ID: NCT03650543) que incluyo 133 sujetos con H. pylori sensibles (exclusivamente) a amoxicilina y claritromicina. La susceptibilidad antibiótica se evaluó mediante dilución en agar. Los polimorfismos de CYP2C19 se determinaron por qPCR (alelos *1,*2 y *3) (Roche®) y por PCR-RFLP (alelo *17). Los sujetos se aleatorizaron en dos grupos: grupo1 recibió tratamiento estándar (amoxicilina, claritromicina y omeprazol), el grupo2 recibió tratamiento personalizado (omeprazol en diferentes dosis de acuerdo al genotipo de CYP2C19 con amoxicilina y claritromicina en dosis estándar). La verificación de la erradicación de la infección se realizó mediante antígenos fecales (Meridian®). La influencia de la erradicación de H. pylori en la metilación de CDH1 y CDKN2A se estudió en una cohorte de 52 sujetos exitosamente tratados, seguidos por 5.5 años y libres de re-infección. La metilación se evaluó antes y después del tratamiento de H. pylori en pooles de ADN de biopsias de antro y cuerpo del estómago. Se realizo combersión con bisulfito utilizando Ez DNA Methylation Lightning Kit (Zymo®). La metilación se analizó mediante Methyligh. Para normalizar y calcular el porcentaje de metilación de la referencia (PMR) se utilizó el estado de metilación de ACTB. Todo los resultados se analizaron con SPSS Statistics V24 de IBM, utilizando un nivel de significancia estadística de P≤0.05. Resultados: El genotipo CYP2C19 más frecuente fue *1/*1 (61.9%), seguida de *17/*17 (15.9%), *1/*2 (8.8%), *17/*2 (6.7%) *1/*17 (5.9%) y *2/*2 (0.8%). Evidensiandose la alta frecuencia de metabolizadores rapidos (67.7%) y ultrarápidos (15.9 %) del IBP, constituyéndose en el primer estudio que describe metabolizadores ultrarápidos en Colombia. La eficacia por intención a tratar (ITT) de la triple terapia con dosis estándar versus la terapia personalizada acorde al polimorfismo de CYP2C19 fue de 84% (IC del 95%: 0.73 a 0.91) versus 92.2% (IC 95%: 0.82 a 0.97) (P=0.14), respectivamente. La eficacia de las terapias por análisis por protocolo (PP) fue de 92.1% (IC 95%: 0.82 a 0.97) versus 100% (IC 95%:0.92‐0.01) (P=0.027), respectivamente. La falla terapeútica observada se presento en individuos metabolizadores rápidos ultra rápidos que no recibieron terapia personalizada. En relación al estado de metilación del promotor de CDH1, el promotor y el exón de CDKN2A, antes de la erradicación se encontró metilación en el 80.8%, 7.7% y 11.5% de los sujetos respectivamente. Después de la erradicación de H. pylori, la metilación disminuyó en los sujetos en 55.7%, 5.7% y 100% respectivamente, encontrándose diferencias significativas para CDH1 (p=0.049). Después de la erradicación de H. pylori el PMR disminuyó en las regiones génicas evaluadas, siendo significativa en CDH1 después de 36 meses de seguimiento (p=0.020), y en sujetos entre y 47-59 años (p=0.020). No se pudo establecer relación entre los PMR y el grado de atrofia gástrica de acuerdo al sistema OLGA puesto que no fue reportado por los patólogos en todos los participantes. Conclusiones: 1. El ajuste personalizado de las dosis de omeprazol de acuerdo al genotipo de CYP2C19, demostró ser una buena estrategia para mejorar la eficacia de las terapias. 2. La erradicación exitosa de H. pylori revierte la metilación de CDH1 y CDKN2A especialmente en sujetos menores de 50 años y con tiempo de seguimiento superior a 60 meses. 3. La metilación residual después de la erradicación de H. pylori en individuos sin riesgo histológico de atrofia gástrica (OLGA 0-II) evidencia que a diferencia de lo sugerido por guias internacionales deben seguirse en el tiempo. Este hallazgo demuestra la utilidad del estudio de la metilación en CHD1 y CDKN2A como posibles biomarcadores tempranos de riesgo que preceden los cambios histopatológicos. 4. Primer estudio occidental con mayor número de sujetos y mayor tiempo de seguimiento que investiga metilación aberrante en individuos con gastritis leve antes y después de la erradicación exitosa de H. pylori. Palabras clavel: H. pylori, erradicación, polimorfismo, CYP2C19, CDH1, CDKN2A.
Límites de especies en el complejo Leucostethus fraterdanieli (Silverstone 1971) (Anura : dendrobatidae) a partir del análisis filogenético molecular, morfológico y cantos
(Pontificia Universidad Javeriana) Rodriguez Suárez, Geven Erasmo; Bolivar-García, Wilmar; Colciencias; Rada-García, Marco Antonio; Sánchez Pacheco, Santiago; Daza, Juan M.; Amézquita Torres, Adolfo; Rivera Correa, Mauricio
Los “complejos de especies” son asunciones taxonomicas a partir del estudio de diversas especies que no presentan claras diferencias ya sean, por características, elementos o caracteres morfológicos, distribución, comportamiento, ecología, diferencias a nivel molecular entre otras, que permitan reconocer claramente grupos monofiléticos. El complejo Leucostethus fraterdanieli contiene a las especies de L. brachistriatus, L. yaguara, L. alacris y a la especie por la cual tomó su nombre. El presente trabajo se propuso explorar las relaciones filogenéticas de las especies del complejo L. fraterdanieli empleando herramientas moleculares y contrastando estos datos con análisis de cantos y morfometría, en las localidades tipo y en otras localidades adicionales donde habían sido reportadas las especies del complejo. Leucostethus alacris no se incluyó en este estudio porque no pudo ser colectada por razones de orden público en la localidad tipo. Se emplearon para los análisis moleculares cuatro regiones del ADN mitocondrial usadas previamente en estudios con dendrobátidos: H1 (compuesto por los fragmentos: 12S y 16S), COI y Cytb. Para los cantos de anuncio se analizaron las siguientes variables: duración del canto, duración del silencio (intervalo entre cantos), frecuencia fundamental o dominante, baja frecuencia, alta frecuencia, tasa de llamadas o número de llamados/minuto y armónicos. Se tomaron 13 medidas morfométricas a todos los individuos colectados para establecer diferencias entre poblaciones y entre machos y hembras. Adicionalmente, se visitaron diferentes colecciones zoológicas para realizar estas mismas mediciones. Los resultados moleculares demostraron la monofilia de L. brachistriatus y L. yaguara, así como la ocurrencia de dos nuevos clados L. sp. “Bitaco” y L. sp. “Chachagüí”, los cuales habían sido referidos en la última revisión de la familia Dendrobatidae y también en el trabajo que describió a L. jota, pero que no habían sido estudiados a profundidad con ejemplares de las localidades tipo, ni abarcando toda el área de la distribución del complejo de especies. Los datos moleculares también permitieron demostrar que los topotipos de Leucostethus fraterdanieli conformaron una especie válida monofilética que fue el grupo hermano de dos clados: el primero, compuesto por L. ramirezi y el otro, compuesto por una politomía compuesta por los topotipos de L. brachistriatus, L. yaguara y demás individuos colectados en diferentes localidades de siete departamentos de Colombia en los que había sido reportados individuos correspondientes a la especie L. fraterdanieli. Leucostethus sp. “Gorgona”, especie aún sin publicar pero que se sabe es una especie presente en la Isla Gorgona, fue el grupo hermano de los clados L. fraterdanieli, L. ramirezi y L. brachistriatus. Los datos morfológicos no arrojaron diferencias que permitieran corroborar o refutar los resultados moleculares referentes a las agrupaciones de la politomía y de la monofilia de Leucostethus fraterdanieli. Los cantos de los topotipos de L. brachistriatus y L. yaguara no fueron diferentes con relación al canto de los topotipos de L. fraterdanieli.
Estudio comparado del desarrollo esquelético y las secuencias de osificación en especies de ranas colombianas
(Pontificia Universidad Javeriana) Arenas Rodríguez, Angélica; Hoyos Hoyos, Julio Mario; Púgener, Lourdes Analía; Abdala, Virginia Sara Luz; Jerez, Adriana; Maldonado Ocampo, Javier Alejandro
Se observaron y describieron el desarrollo larvario del esqueleto de especies colombianas de las familias más diversificadas: Rhinella marina (Bufonidae), Dendropsophus labialis, D. minutus, Boana xerophylla, Scinax ruber y Trachycephalus typhonius (Hylidae) y Engystomops pustulosus, Leptodactylus insularum y L. colombiensis (Leptodactylidae), obtenidas de colecciones biológicas. Se realizó una aclaración enzimática y coloración diferencial para describir y comparar las estructuras esqueléticas del cráneo y del poscráneo. Se obtuvieron las secuencias de osificación para analizar la variación de elementos con métodos gráficos y estadísticos. A partir de las secuencias, y con lo recopilado de la literatura, se ubicaron los cambios heterocrónicos en un árbol filogenético, usando el algoritmo de Parsimov. Se encontraron diferencias en el tiempo de aparición de los primeros elementos osificados, tales como las apófisis transversas de las vértebras. Al considerar solo el cráneo los primeros elementos fueron el exoccipital, el paraesfenoides y el frontoparietal: en Hylidae fue en etapas de desarrollo temprana y en Leptodactylidae en etapas tardías. Los rangos y el número de elementos presentaron variabilidad en los momentos de osificación en todas las especies, siendo de menor número en los leptodactílidos, con respecto a los hílidos. En el bufonído no se encontró osificaciones en los estadios evaluados. los Al considerar todo el esqueleto, se observó la relevancia de los elementos del poscráneo. Con Parsimov se identificaron heterocronías en diferentes agrupaciones de anfibios a partir de la ontogenia del esqueleto encontrándose procesos pedomórficos en anuros colombianos.
Evaluación de la respuesta de los linfocitos T durante la infección crónica por Trypanosoma cruzi y su relación con el control de la infección
(Pontificia Universidad Javeriana) Mateus Triviño, Jose Yesid; Cuéllar Avila, Adriana; Puerta Bula, Concepción Judith; Gómez, María Adelaida; Roa, Nelly Stella; Parra, Carlos A.; Franco, Manuel A.; Gruppi, Adriana; Patarroyo, Manuel Alfonso
El parásito protozoo intracelular Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, establece un estado crónico de infección, que en aproximadamente el 60% de los individuos cursa con ausencia de síntomas durante toda la vida; sin embargo, el resto de los individuos desarrollan alteraciones cardiacas o digestivas que los pueden llevar a la muerte (Perez-Molina et al., 2018). Aunque a ¬la fecha no se conoce con certeza el papel que juega el sistema inmune en el desenlace de la infección por T. cruzi, en modelos múridos de la enfermedad de Chagas se ha descrito que los Linfocitos T (LT) y su respuesta efectora son necesarias para el control de la parasitemia y la sobrevida de los ratones (Tarleton et al., 1994; Tzelepis et al., 2006). Además, a la fecha, si bien el mecanismo relacio¬¬nado con la patología de la enfermedad de Chagas no es claro, estudios han sugerido que la falla en el control de la infección por el parásito estaría relacionada con el desenlace de la misma. En humanos con infección crónica por T. cruzi se ha mostrado que individuos asintomáticos presentan aumento en la frecuencia de LT con menor grado de diferenciación celular, mayor capacidad multifuncional y menor expresión de receptores inhibitorios en comparación con pacientes con las formas severas de la enfermedad de Chagas (Lasso et al., 2015; Mateus et al., 2015), sin embargo, se desconoce si estos hallazgos están relacionados con el control de la infección crónica por T. cruzi. En estudios realizados en humanos y ratones en modelos de enfermedades infecciosas se ha encontrado que un aspecto que puede contribuir a la eliminación o al control eficiente de agentes infecciosos está relacionado con la calidad de la respuesta funcional de los LT (Appay et al., 2002; Bengsch et al., 2010; Betts et al., 2006; Bhadra et al., 2011; Esch et al., 2013; Riou et al., 2012; Wherry, Teichgraber, et al., 2003). Teniendo en cuenta la historia natural de la enfermedad de Chagas, la dificultad para seguir y documentar los individuos infectados hasta por 40 años y para establecer la relación entre el control de la infección por T. cruzi con la respuesta funcional de los LT, en el presente estudio se usaron dos enfoques metodológicos para dar respuesta al siguiente interrogante: ¿cuál es la relación de la repuesta funcional de los LT con el control de la infección por T. cruzi? En vista que reportes han mostrado que el tratamiento antiparasitario reduce la carga parasitaria en individuos y ratones con infección crónica por T. cruzi (Bustamante et al., 2008; Morillo et al., 2015) y que este podría ser útil para entender si el control de la infección por el parásito en individuos crónicamente infectados y tratados estaría relacionada con cambios en la respuesta funcional de los LT, en el primer enfoque se evaluó el efecto del tratamiento antiparasitario sobre la capacidad funcional de la respuesta de los LT de pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica (PCC). Por otro lado, el segundo enfoque incluyó el uso del modelo múrido experimental de infección por T. cruzi, una herramienta que ha mostrado ser útil para el estudio de la enfermedad de Chagas. Con este enfoque se determinó la respuesta funcional de los LT en el modelo experimental de infección por T. cruzi y su relación con el control de la infección evaluado por la carga parasitaria y el daño en el tejido. Para desarrollar este enfoque, primero se estableció un modelo de infección aguda y crónica con el propósito de determinar si durante la infección crónica, al igual que en los humanos, se observaba el deterioro de los LT. Posteriormente, teniendo en cuenta que una limitación para el estudio de la infección crónica por T. cruzi en humanos y modelos múridos es la cuantificación de la carga parasitaria y del daño en tejido y que se ha documentado que la variabilidad genética del parásito o las reinfecciones pueden tener un impacto en el curso y desenlace de la infección por T. cruzi (Andrade et al., 2006; Bustamante et al., 2007; Bustamante et al., 2002; Perez et al., 2018; Santi-Rocca et al., 2017), se evaluó si la respuesta de los LT se relaciona con el control de la infección en un modelo múrido de infección con cepas de dos grupos genéticos del parásito y durante la reinfección o infección mixta por cepas de T. cruzi. Con el desarrollo de este trabajo, usando los enfoques mencionados anteriormente, se encontró que posterior al tratamiento antiparasitario de PCC se evidencia una mejor calidad de la respuesta de LT al comparar con PCC sin tratamiento antiparasitario. Esto fue revelado por mayor frecuencia de LT con un menor grado de diferenciación celular (TCM), aumento de la capacidad funcional y multifuncional de los LT y disminución de la expresión de receptores inhibitorios en LT. Por otro lado, en el modelo experimental de infección se encontró que la infección aguda con la cepa Y de T. cruzi conduce al aumento de la carga parasitaria y del infiltrado inflamatorio en tejido, aumento de células efectoras, la generación de LT multifuncionales específicos de antígeno y su regulación mediante la alta expresión de receptores inhibitorios; en contraste, ratones con infección crónica con la cepa Y del parásito presentaron bajos niveles de carga parasitaria y del infiltrado inflamatorio en tejido y deterioro de la respuesta de los LT caracterizada por aumento de células con mayor grado de diferenciación (TEM), disminuida capacidad funcional y aumento en la expresión de receptores inhibitorios. Al comparar estos resultados con los hallazgos de los ratones infectados con la cepa DA de T. cruzi, se encontró menor carga parasitaria e infiltrado inflamatorio en tejido y una respuesta de LT caracterizada por células con menor grado de diferenciación celular, mayor capacidad funcional y disminuida expresión de receptores inhibitorios durante la infección aguda y crónica por T. cruzi. Posteriormente, en vista de que las reinfecciones detectadas en individuos naturalmente infectados pueden estar relacionadas con la progresión de la enfermedad de Chagas (Perez et al., 2014; Zicker et al., 1990) y que en modelos animales experimentales se ha mostrado que las reinfecciones conducen a la falla en el control de la infección (evidenciada por alta carga parasitaria y alto infiltrado inflamatorio en tejido) (Andrade et al., 2006; Bustamante et al., 2007; Bustamante et al., 2002; Perez et al., 2018), se evaluó si la respuesta funcional de los LT se relaciona con el control de la infección crónica por el parásito en un modelo múrido de reinfección por cepas de T. cruzi. Se encontró menor carga parasitaria en ratones infectados y reinfectados con la cepa Y (Y/Y) en comparación con ratones infectados con la cepa DA y reinfectados con la cepa Y (DA/Y). De manera interesante, los ratones infectados con Y/Y presentaron una mejor respuesta de los LT, caracterizada por aumento de LT con un menor grado de diferenciación celular (TCM) y disminución de la expresión de receptores inhibitorios en LT en comparación con los ratones DA/Y. Finalmente, un análisis de correlación mostró que hay una relación entre la calidad de la repuesta de los LT con el control de la infección en ratones sometidos a infecciones mixtas por cepas del parásito. Por lo tanto, tomando en consideración los hallazgos mencionados anteriormente, tanto en PCC sin y con tratamiento antiparasitario como en el modelo experimental de infección y reinfección por T. cruzi, los resultados nos permiten concluir que la calidad de la respuesta de los LT se relaciona con el control de la infección por el parásito. Estos hallazgos son un precedente para entender los mecanismos relacionados con la progresión de la enfermedad de Chagas en humanos crónicamente infectados y diseñar estrategias de control y seguimiento de los individuos infectados.
Efecto de un nuevo enfoque en consejería en lactancia materna exclusiva en la prevalencia de la lactancia materna exclusiva, velocidad de crecimiento hasta los cuatro meses y la pérdida de peso post parto en mujeres con sobrepeso u obesidad
(Pontificia Universidad Javeriana) Aldana Parra, Fanny Isabel; Fewtrell, Mary; Olaya Vega, Gilma Aurora; Lutter, Chessa; Campoy, Cristina; Granados, Claudia; Pinzón-Villate, Gloria; Benjumea, Maria Victoria
El sobrepeso materno se ha considerado un factor de riesgo de obesidad infantil. La lactancia materna podría disminuir este riesgo, pero la práctica de la lactancia en mujeres con sobrepeso/obesidad es baja. Se realizó un ensayo aleatorizado controlado en 90 gestantes con exceso de peso, para evaluar los efectos de la consejería en lactancia materna exclusiva (LME) basada en la teoría de Carl Rogers sobre la duración de LME, crecimiento infantil y pérdida de peso hasta 4 meses post parto (resultados primarios); y la concentración de prolactina sérica y en leche materna, energía, macronutrientes y volumen de leche materna 1 y 4 meses post parto (resultados secundarios). Las mujeres fueron asignadas aleatoriamente a la consejería en LME (GI) o al apoyo estándar (GC). El seguimiento se realizó durante 4 meses post parto. El GI tuvo una probabilidad casi 3 veces mayor de lactar exclusivamente a los 4 meses, comparados con el GC (RP=2.7; 95% CI 1.6, 4.5; p=0.0002). No hubo efecto en la velocidad de crecimiento, pérdida de peso materno o los resultados secundarios. El volumen de leche materna que fue mayor en el GI al mes y 4 meses (p = 0,001 y p = 0,04 respectivamente). La intervención, que podría implementarse atención primaria, fue altamente efectiva para aumentar la prevalencia de LME en madres con sobrepeso u obesidad a los 4 meses post parto. La falta de asociación con los resultados secundarios podría deberse al corto seguimiento y al pequeño tamaño de muestra. Se requiere una evaluación adicional de la intervención en una muestra más grande y a largo plazo.
Factores ambientales y antrópicos que determinan la presencia y distribución del cóndor andino y la selección de lugares de anidación y descanso : un enfoque multiescalar
(Pontificia Universidad Javeriana) Sáenz Jiménez, Fausto Alexis; Pérez Torres, Jairo; Sheppard, James K.; Londoño, María Cecilia; Lambertucci, Sergio; Kattan, Gustavo; Echeverry Galvis, María Ángela; Laverde Rodríguez, Oscar Alberto
El Cóndor Andino a nivel mundial se encuentra catalogado como Casi Amenazado (NT) por la tendencia a la reducción de sus poblaciones. En Colombia para la década de los 80 sus poblaciones se encontraban reducidas en número y su distribución se restringía a pocas localidades en los extremos de su distribución geográfica original. Desde hace más de 20 años se iniciaron en el país procesos de reintroducción en los que se han liberado 69 individuos. Sin embargo, se desconoce el estado real de sus poblaciones (i.e. abundancia, estructura). Debido a la poca constancia de las técnicas de seguimiento utilizadas también se desconoce si las medidas de manejo implementadas han sido efectivas. Es evidente la falta de información sobre las condiciones que determinan su área de acción, el uso de hábitat, su distribución y la selección de los lugares de anidación y descanso por parte del cóndor. Sin esta información, los planes de manejo y conservación propuestos no pasan de ser teóricas. En la presente investigación doctoral se caracterizaron los factores ambientales (climáticos y topográficos) y antrópicos que influyen en la distribución y en la selección de lugares de anidación y descanso por parte del Cóndor Andino a una escala de microhábitat, local, ecoregional y biogeográfica. La tesis se desarrolló mediante cuatro capítulos. En el primer capítulo se evaluaron las variables ambientales, topográficas y antrópicas que tienen influencia en la selección de los sitios de refugio (nidos y dormideros) por parte del cóndor andino. Se ubicaron riscos seleccionados por los cóndores y se compararon con riscos de características similares, pero no utilizados como sitios de refugio. En cada risco se registraron variables climáticas (temperatura, humedad relativa), variables topográficas (orientación, altura desde la base, ancho del risco, pendiente, accesibilidad) y variables antrópicas (distancia a vías, distancia a centros poblados, heterogeneidad de coberturas). La variabilidad en la temperatura y en la humedad relativa, la distancia a las vías secundarias y a las casas, y la heterogeneidad en las coberturas fueron las variables que más explicaron (PCA y regresión logística) la selección de sitos de refugio por parte de la especie. En el segundo capítulo se estimó el área de acción de una pareja de cóndores (macho y hembra) reintroducidos, a los cuales se les hizo seguimiento mediante técnicas de telemetría satelital. Las grandes diferencias en los desplazamientos y las áreas de acción entre el macho y la hembra posiblemente reflejan el comportamiento jerárquico de esta especie, que obligan a que la hembra realice mayores desplazamientos en búsqueda de alimento. En el capítulo tres, mediante la elaboración de modelos de nicho ecológico se identificaron las áreas de mayor idoneidad para la presencia del cóndor en Colombia. Además, se evaluó la ubicación proyectada en los modelos respecto al Sistema Nacional de Áreas Protegidas (SINAP) y los núcleos de reintroducción. Se estimó una distribución potencial para el cóndor andino en Colombia de 83808 Km2 de los cuales menos del 25% se encuentran dentro de áreas protegidas. De las áreas con mayor idoneidad para la presencia de la especie, menos del 30% se encuentran representadas en SINAP. La mayoría de núcleos de reintroducción contienen áreas de alta idoneidad para el cóndor Andino, con excepción del PNN Nevados. Algunas áreas de alta idoneidad identificadas por el modelo coincidieron con las zonas de anidación y descanso que se identificaron en campo. Finalmente, en el cuarto capítulo mediante el uso de modelado de nicho ecológico y herramientas SIG se evaluó el efecto del cambio climático y la influencia humana sobre la distribución del cóndor Andino y las áreas de simpatría futuras con el buitre negro americano (Coragyps atratus). Se encontró que el área de distribución del cóndor Andino para escenarios de cambio climático disminuirá entre el 18% y el 32%, mientras que para C. atratus el área se reducirá entre el 16% y el 60%. Las reducciones en el área son más notorias para el escenario del año 2070 con mayores emisiones de gases de efecto invernadero (RCP 8.5). Se predice una reducción de las áreas de simpatría entre las dos especies en escenarios futuros y un desplazamiento en el gradiente altitudinal. Aunque el área de simpatría general se reducirá, se predice una tendencia a aumentar específicamente para los países del norte de los Andes (Ecuador, Colombia y Venezuela) en los cuales la especie se encuentra en mayor grado de amenaza. No se predice un efecto significativo en escenarios futuros de influencia humana sobre la distribución del cóndor Andino. En general se pudo constatar que las variables que intervienen en la distribución y selección de los lugares de refugio por parte del cóndor varían con la escala. A escala local (microhábitat - paisaje) variables antrópicas como la presencia de carreteras y de asentamientos humanos, junto con los comportamientos jerárquicos, influyen en cómo el cóndor andino usa el espacio y selecciona sus lugares de descanso y anidación. A escala regional se evidencia que principalmente el clima (temperatura mínima del mes más frío, isotermalidad y precipitación del mes más húmedo) determina su distribución. Por último, en una escala continental, el clima (particularmente los cambios proyectados para el clima futuro) influye sobre la distribución de la especie y sobre las posibles interacciones que se presentarán con especies similares como C. atratus. Se prevé que el norte de los Andes será la región donde deberán enfocarse los mayores esfuerzos de manejo y conservación de esta especie.
Filogeografía comparativa de cinco taxones de felinos neotropicales (Jaguar, Panthera onca; Jaguarundi, Puma yagouaroundi; Ocelote, Leopardus pardalis; Margay, Leopardus wiedii y el complejo de especies de tigrillos; Felidae, Carnivora, Mammalia) mediante análisis del ADN mitocondrial
(Pontificia Universidad Javeriana) Pinedo Castro, Myreya Omayra Zoraida; Ruiz García, Manuel; Rueda Zozaya, Maria del Pilar; Flanagan, Nicola Sian; Castillo Amézquita, Maria Ignacia; Pinto Báez, Miguel; Pérez Torres, Jairo
Los estudios con ADN para las especies de felinos silvestres del Neotrópico se han basado en números reducidos de muestras y de marcadores moleculares, en áreas geográficas específicas y en la mayoría de los casos, con muestras de animales con orígenes geográficos inciertos. En este trabajo, se analizaron la filogeografía, sistemática molecular y algunas características de la evolución genética de cinco especies de felinos neotropicales (Panthera onca, Puma yagouaroundi, Leopardus pardalis, Leopardus wiedii y Leopardus tigrinus), mediante las secuencias de tres genes mitocondriales: ATP8, 16S rRNA y NADH5 y mitogenomas para un número significativo de muestras obtenidas directamente de la naturaleza. Mediante el análisis de diversidad genética, se encontró que, para las cinco especies, los niveles son elevados. En cuatro especies, el número de acervos genéticos es menor que el de las subespecies morfológicas consideradas por los zoólogos excepto para el tigrillo. Se confirmó a L. guttulus como especie y se revela la existencia de dos posibles especies de tigrillos para Colombia y Ecuador. Los análisis bayesiano y distribución mismatch mostraron evidencias de que las cuatro especies de mayor porte y el complejo de especies de tigrillos, pasaron por expansiones poblacionales durante el pleistoceno lo cual significa que los mismos procesos afectaron la evolución genética de estos organismos. Además, se demuestra que el análisis de un gran número de ejemplares con la mayor diversificación geográfica posible, es necesario para detectar agrupaciones regionales de trascendencia sistemática (por ejemplo, por debajo del nivel de especie), aunque el número de marcadores sea bajo.
Caracterización de mecanismos de estrés asociados con apoptosis y señales inmunogénicas en células de melanoma murino tratadas con un extracto de plantas rico en polifenoles
(Pontificia Universidad Javeriana) Prieto Sarmiento, Karol Mildred; Barreto Prieto, Alfonso; Fiorentino Gómez, Susana; Cubillos Ruiz, Juan; Parra López, Carlos Alberto; Sutachan Rubio, Jhon Jairo; Camacho Navarro, Maria Marcela; Hata Uribe, Yoshie Adriana
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, los tratamientos para controlar esta enfermedad se basan en la inducción de la muerte de la célula tumoral. En condiciones fisiológicas esa inducción de muerte celular es inmunológicamente silenciosa (tolerogénica). Sin embargo, durante el tratamiento con algunas terapias antitumorales (como antraciclinas, radioterapia y terapia fotodinámica) se puede generar una muerte celular que estimula la respuesta inmune antitumoral. Esta muerte celular denominada muerte celular inmunogénica (MCI) se caracteriza por el incremento de señales de peligro, entre las que se encuentran la exposición de calreticulina en la membrana celular (Ecto-CRT) y la liberación de ATP y de la proteína HMGB-1 (high mobility group box 1). Se ha descrito que la mayoría de los inductores de MCI, directa o indirectamente inducen estrés oxidativo con la generación de estrés de retículo endoplásmico (RE) y autofagia, para la liberación de señales inmunogénicas. Estos mecanismos de estrés indistintamente pueden contribuir con la sobrevivencia o la inducción de la muerte celular durante el tratamiento, o incluso algunos de ellos favorecen en el microambiente tumoral la generación de células con capacidad inmunosupresora. Debido a la alta resistencia presentada en cáncer como consecuencia del uso de medicamentos que presentan un solo blanco molecular, se han empezado a utilizar combinaciones farmacológicas para tratar de mejorar la muerte celular, en la MCI por ejemplo, se propone combinar fármacos que activen la respuesta al estrés en diferentes organelos para lograr la inducción de todas las señales de peligro. Por otra parte, en la búsqueda de nuevas y eficientes terapias antitumorales que puedan modular positivamente la respuesta inmune, se han venido desarrollando una serie de medicamentos derivados de plantas, los cuales son ricos en polifenoles (compuestos antioxidantes con diferentes actividades antitumorales, antiinflamatorias y antimetastásicas), entre otros . En este sentido, en el grupo de Inmunobiología y Biología Celular de la Pontificia Universidad Javeriana se obtuvo un extracto rico en polifenoles derivado de la planta Caesalpinia spinosa, denominado P2Et. El P2Et ha demostrado tener actividad antitumoral in vitro sobre líneas de cáncer de seno y melanoma, a través de la inducción de apoptosis, autofagia y de señales involucradas con MCI. Estos resultados fueron confirmados en modelos in vivo de cáncer de seno y melanoma en los que se mostró que el tratamiento con P2Et disminuye el tumor de una forma dependiente de la respuesta inmune con la generación de linfocitos T más eficientes y una disminución en células mieloides supresoras. Para determinar cuáles mecanismos utilizan los extractos de plantas ricos en polifenoles como el P2Et y los polifenoles que se asocian a ese tipo de extractos, para favorecer la inducción de MCI, en este trabajo se hizo un análisis mecanístico en donde se evaluó el papel del estrés de retículo y la autofagia en la inducción de muerte celular y en la generación de señales inmunogénicas. Para ello se utilizaron células B16-F10 de melanoma murino, las cuales fueron tratadas con P2Et o con los dos polifenoles más abundantes en el extracto ácido gálico (AG) y etil galato (EG, y se combinaron con inhibidores químicos de estrés de RE y de autofagia. Por otra parte, se generaron clones de células B16-F10 carentes de genes necesarios para la activación de estrés de RE y de autofagia utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y se trataron con el extracto y los polifenoles. Cuando se evaluó la inducción de estrés de RE, se observó un incremento significativo en las vías de señalización de PERK e IRE-1alpha con P2Et llamando la atención que no hubo incremento de las especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, no se observó incremento en la inducción de estrés de RE con AG y solo un ligero incremento con EG que no fue significativo. La muerte celular mediada por P2Et fue totalmente dependiente de la activación de PERK, que llevo al incremento en los niveles de calcio citoplasmático y a su vez, estos se asociaron con pérdida del potencial de la membrana mitocondrial y la inducción de muerte por apoptosis. Por otra parte, la inhibición de la autofagia aumento la muerte mediada por P2Et y EG, mientras que disminuyó la muerte en células tratadas con AG, sugiriendo que este último induce una autofagia citotóxica. Adicionalmente, se encontró que de los dos polifenoles solo el EG induce señales de MCI pero en menor proporción comparado con P2Et. Interesantemente, se identificó que la vía PERK es necesaria también para la expresión de los tres marcadores de muerte inmunogénica estudiados en células tratadas con P2Et y que la autofagia contribuye con la liberación de CRT y ATP. Estos resultados demuestran que el mecanismo por el cual P2Et induce MCI es diferente a los mecanismos previamente descritos para otros inductores de MCI, además que el uso del extracto complejo es ventajoso frente al uso de los polifenoles aislados, lo cual confirma el potencial que tienen los extractos complejos en el tratamiento del cáncer.
Molecular mechanisms involved in the protective effects of tibolone in astrocytic cells treated with palmitic acid
(Pontificia Universidad Javeriana) González Giraldo, Yeimy; Sampaio Barreto, George Emilio; Forero Garzón, Diego A.; Fonseca Mendoza, Dora; Vargas Vargas, Rafael; Castellanos Castañeda, Gabriel; Sánchez Mora, Ruth; Felipe Aristizabal, Andrés
La obesidad se asocia con un aumento de la neuroinflamación crónica e incrementa el riesgo de neurodegeneración. Esto empeora durante el proceso de envejecimiento normal cuando se reducen los niveles de hormonas gonadales endógenas. La tibolona es un esteroide sintético utilizado para la terapia hormonal durante la posmenopausia y tiene efectos estrogénicos, progestogénicos y androgénicos. En estudios clínicos y preclínicos, se ha observado que la tibolona tiene acciones antioxidantes, antiinflamatorias y antidepresivas. Sin embargo, se desconoce su acción sobre células astrocitarias expuestas al ácido palmítico, un ácido graso utilizado para modelar la obesidad in vitro. Esta tesis demuestra que la tibolona previene la muerte celular y protege las células T98G contra el daño mitocondrial y los cambios morfológicos inducidos por el ácido palmítico. El efecto de la tibolona sobre las mitocondrias fue mediado por el receptor de estrógeno β. El análisis de la expresión génica mostró que la tibolona tiene un efecto antiinflamatorio debido a sus acciones para reducir la expresión de los genes IL6, IL1B y miR155-3p. Interesantemente, la tibolona atenuó el aumento de la expresión de los genes involucrados en los mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN (DNMT3B) y el complejo telomérico (TERT, TERC) inducidos por el ácido palmítico. Finalmente, se observó que la inhibición de la telomerasa (TERT) redujo la expresión de IL6 en células tratadas con ácido palmítico e interfirió con el efecto protector de la tibolona sobre la muerte celular. Este estudio mostró por primera vez los principales mecanismos moleculares implicados en los efectos de la tibolona en un modelo de obesidad in vitro. Esta tesis contribuye a un nuevo conocimiento sobre la biología molecular y celular de la proteína telomerasa, ya que es el primer trabajo que evalúa el papel del TERT en las acciones de tibolona y ácido palmítico. Estos resultados demuestran que la tibolona tiene efectos beneficiosos sobre las células astrocíticas a nivel celular y molecular, y sugieren que la tibolona podría ser un esteroide neuroactivo con acciones terapéuticas sobre diferentes enfermedades. Sin embargo, estudios futuros en modelos in vivo son necesarios para evaluar la posible aplicación clínica de tibolona en el tratamiento de enfermedades que afectan el sistema nervioso central.

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