Síntesis y evaluación histológica de constructos tridimensionales que promueven la interacción de células mesenquimales con ectodermo oral embrionario de ratas Lewis para la obtención de tejidos semejantes a dientes

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Date
2012Authors
Jaramillo Gómez, Lorenza MaríaDirectors
Briceño Balcazar, IgnacioPublisher
Pontificia Universidad Javeriana
Faculty
Facultad de Ciencias
Program
Doctorado en Ciencias Biológicas
Obtained title
Doctor en Ciencias Biológicas
Type
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Doctorado
COAR
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Resumen
Con el propósito de lograr la formación de una estructura similar a un diente, se estratificaron células de ectodermo oral embrionario con células troncales de medula ósea (CTMO) dentro de una matriz de hidrogel sintético (PEGDA) que se implantó en mesenterio de machos adultos de ratas Lewis. Mediante hibridización in situ de bloque completo, se evaluó la expresión de tres genes iniciadores putativos de la formación dental (Pitx2, Shh y Wnt10a), con lo cual se estableció que en ratas las señales iniciadoras de odontogénesis aparecen entre E12.5 y E13. El tejido ectodérmico embrionario se obtuvo por medio de cruces controlados de hembras a las que se les detectó el estro mediante impedanciometría. En E12.5 las hembras se sacrificaron y se extrajeron los embriones. Se disecó la porción mandibular del primer arco branquial bajo estereomicroscopio y el ectodermo se separó del mesénquima mediante disociación enzimática con una solución de tripsina y pancreatina. Las CTMO se extrajeron de los huesos largos de las extremidades posteriores de ratas mediante lavado con ?-MEM y se cultivaron en cajas de 25 cm2 hasta un segundo pasaje. Las CTMO fueron recombinadas con ectodermo embrionario competente (E12.5-E13) estratificándolas en un soporte tridimensional de PEGDA polimerizado con luz ultravioleta (365 nm) dentro de un molde piramidal de polipropileno (PP). Los constructos se cultivaron entre 48 y 72 horas en DMEM y posteriormente fueron implantados en el mesenterio de machos adultos (3 a 6 meses de edad) por un período de cuatro a seis semanas.
Abstract
In order to obtain a tooth-like structure, embryonic oral ectoderm cells and bone marrow derived stem cells (BMSC) were stratified within a synthetic hydrogel matrix (PEGDA) and implanted in the mesentery of adult male Lewis rats. Whole mount in situ hybridization was used to evaluate the expression of Pitx2, Shh and Wnt10a signals indicative of tooth initiation. In rats, the three markers expressed were present in the oral ectoderm starting at E12.5 and E13, thus this embryonic stage was selected for cell harvesting. Embryos were obtained by controlled service of young female Lewis rats in which estrous was detected by impedance readings. E12.5 pregnant rats were sacrificed to collect embryos, of which mandibular primordia of embryos were dissected and mesenquime was separated from the ectoderm by enzymatic digestion with a pancreatine trypsine solution. BMSC s were collected by flushing the medulla of tibia and femora of adult Lewis rats with ?-MEM and cultured in ?-MEM in 25 cm2 flasks.
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