Erradicación de helicobacter pylori : una propuesta desde la farmacogenética y la epigenética en una población de Bogotá
Fecha
2019-12-12Autor(es)
Arévalo Galvis, AzucenaDirector(es)
Trespalacios Rangel, Alaba AliciaEvaluador(es)
Alarcón, TeresaPérez Pérez, Guillermo Ignacio
Zabaleta, Jovanny
López Segura, Valeriano
Corredor, Mauricio
Publicador
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad
Facultad de Ciencias
Programa
Doctorado en Ciencias Biológicas
Título obtenido
Doctor en Ciencias Biológicas
Autor(es) Corporativo(s)
Pontificia Universidad Javeriana
Tipo
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Doctorado
COAR
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Citación
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Título en inglés
Helicobacter pylori eradication : a proposal from pharmacogenetics and epigenetics in a population of BogotáResumen
Antecedentes: Helicobacter pylori (H. pylori), es la principal causa de gastritis crónica, ulceras pépticas, linfoma MALT gástrico y cáncer gástrico (GC) (1). Consensos internacionales recomiendan erradicar la infeción (2-6). Sin embargo, la eficacia de las terapias triples de primera línea es inferior al 80%. En Colombia Trespalacios et al. 2011 reportaron que la eficacia de la terapia triple estándar (Inhibidor de bomba de protones (IBP) + amoxicilina + claritromicina) es 71% y la triple terapia con levofloxacina es 75% (7). La principal causa de fracasos terapéuticos es la resistencia bacteriana (8). No obstante, en Colombia 12.5% de los tratamientos fallan aun en ausencia de resistencia bacteriana (7). Una explicación a esto, es la falta de eficacia de los IBPs para bloquear la producción de ácido gástrico, ya que la farmacocinética de los IBPs se ve afectada por factores farmacogenéticos del individuo como la presencia de polimorfismos en la enzima del sistema citocromo P450 (CYP) 2C19, encarcada de metabolizar los IBPs (lansoprazol, pantoprazol y omeprazol) (9,10,11). Dependiendo del polimorfismo los individuos metabolizaran rápida o lentemente los IBPs, de tal manera que la capacidad de inhibición del ácido será diferente en cada individuo (12). Los IBPs son fundamentales en las terapias de erradicación ya que al elevar el pH gástrico aumentan la eficacia de los antibióticos sensibles al ácido como claritromicina y amoxicilina (12) por esto, conocer la distribución de estos polimorfismos permitiria personalizar las terapias. La erradicación exitosa de H. pylori tiene muchos beneficios (13-17) particularmente en lugares con alta incidencia de cáncer gástrico (18). En Colombia la incidencia de CG para el año 2018 fue de 7419 casos, siendo el tercer cancer más prevalente en nuestro pais (19), y sin las medidas de prevención efectivas su incidencia permanecería estable o incluso podría aumentar para el 2030 (18), por lo que, lograr una terapia de erradicación eficaz a largo plazo impactaría en su prevención (20). Sin embargo, erradicar la infección no garantiza que la mucosa gástrica se restablese en su totalidad ya que se ha documentado “un punto de no retorno” (17), probablemente relacionado con alteraciones genéticas y epigeneticas que H. pylori induce sobre la célula epitelial gástrica desde el inicio de la infección y se acumulan a lo largo del proceso infeccioso (21, 22). El evento epigenético más temprano que ocurre en gastritis crónica es la hipermetilación aberrante en genes supresores de tumor que codifican para cadherina (CDH1) y inhibidor 2A de quinasa dependiente de ciclina, (CDKN2A), cuyas metilaciones conducen a la reducción de su expresión y posterior disfunsión en la unión célula a célula y del ciclo celular (15). Estos cambios epigeneticos son potencialmente reversibles por lo que la erradicación exitosa del microorganismo podría revertir este proceso (15), sin embargo, actualemente en el mundo esto continua siendo motivo de estudio.
Objetivo: Determinar la influencia de los polimorfismos genéticos de CYP2C19 en la erradicación de H. pylori y de manera prospectiva en ausencia de resistencia bacteriana, determinar si al erradicar la infección se elimina o disminuye la metilación de los genes CDH1 y CDKN2A, los cuales se consideran cambios epigenéticos fundamentales en la carcinogénesis gástrica durante la infección por H. pylori.
Metodología: La influencia de los polimorfismos de CYP2C19 en la erradicación de H. pylori se evaluó mediante un experimento clínico aleatorizado doble ciego (ClinicalTrials.gov ID: NCT03650543) que incluyo 133 sujetos con H. pylori sensibles (exclusivamente) a amoxicilina y claritromicina. La susceptibilidad antibiótica se evaluó mediante dilución en agar. Los polimorfismos de CYP2C19 se determinaron por qPCR (alelos *1,*2 y *3) (Roche®) y por PCR-RFLP (alelo *17). Los sujetos se aleatorizaron en dos grupos: grupo1 recibió tratamiento estándar (amoxicilina, claritromicina y omeprazol), el grupo2 recibió tratamiento personalizado (omeprazol en diferentes dosis de acuerdo al genotipo de CYP2C19 con amoxicilina y claritromicina en dosis estándar). La verificación de la erradicación de la infección se realizó mediante antígenos fecales (Meridian®).
La influencia de la erradicación de H. pylori en la metilación de CDH1 y CDKN2A se estudió en una cohorte de 52 sujetos exitosamente tratados, seguidos por 5.5 años y libres de re-infección. La metilación se evaluó antes y después del tratamiento de H. pylori en pooles de ADN de biopsias de antro y cuerpo del estómago. Se realizo combersión con bisulfito utilizando Ez DNA Methylation Lightning Kit (Zymo®). La metilación se analizó mediante Methyligh. Para normalizar y calcular el porcentaje de metilación de la referencia (PMR) se utilizó el estado de metilación de ACTB. Todo los resultados se analizaron con SPSS Statistics V24 de IBM, utilizando un nivel de significancia estadística de P≤0.05.
Resultados: El genotipo CYP2C19 más frecuente fue *1/*1 (61.9%), seguida de *17/*17 (15.9%), *1/*2 (8.8%), *17/*2 (6.7%) *1/*17 (5.9%) y *2/*2 (0.8%). Evidensiandose la alta frecuencia de metabolizadores rapidos (67.7%) y ultrarápidos (15.9 %) del IBP, constituyéndose en el primer estudio que describe metabolizadores ultrarápidos en Colombia. La eficacia por intención a tratar (ITT) de la triple terapia con dosis estándar versus la terapia personalizada acorde al polimorfismo de CYP2C19 fue de 84% (IC del 95%: 0.73 a 0.91) versus 92.2% (IC 95%: 0.82 a 0.97) (P=0.14), respectivamente. La eficacia de las terapias por análisis por protocolo (PP) fue de 92.1% (IC 95%: 0.82 a 0.97) versus 100% (IC 95%:0.92‐0.01) (P=0.027), respectivamente. La falla terapeútica observada se presento en individuos metabolizadores rápidos ultra rápidos que no recibieron terapia personalizada.
En relación al estado de metilación del promotor de CDH1, el promotor y el exón de CDKN2A, antes de la erradicación se encontró metilación en el 80.8%, 7.7% y 11.5% de los sujetos respectivamente. Después de la erradicación de H. pylori, la metilación disminuyó en los sujetos en 55.7%, 5.7% y 100% respectivamente, encontrándose diferencias significativas para CDH1 (p=0.049). Después de la erradicación de H. pylori el PMR disminuyó en las regiones génicas evaluadas, siendo significativa en CDH1 después de 36 meses de seguimiento (p=0.020), y en sujetos entre y 47-59 años (p=0.020). No se pudo establecer relación entre los PMR y el grado de atrofia gástrica de acuerdo al sistema OLGA puesto que no fue reportado por los patólogos en todos los participantes.
Conclusiones:
1. El ajuste personalizado de las dosis de omeprazol de acuerdo al genotipo de CYP2C19, demostró ser una buena estrategia para mejorar la eficacia de las terapias.
2. La erradicación exitosa de H. pylori revierte la metilación de CDH1 y CDKN2A especialmente en sujetos menores de 50 años y con tiempo de seguimiento superior a 60 meses.
3. La metilación residual después de la erradicación de H. pylori en individuos sin riesgo histológico de atrofia gástrica (OLGA 0-II) evidencia que a diferencia de lo sugerido por guias internacionales deben seguirse en el tiempo. Este hallazgo demuestra la utilidad del estudio de la metilación en CHD1 y CDKN2A como posibles biomarcadores tempranos de riesgo que preceden los cambios histopatológicos.
4. Primer estudio occidental con mayor número de sujetos y mayor tiempo de seguimiento que investiga metilación aberrante en individuos con gastritis leve antes y después de la erradicación exitosa de H. pylori.
Palabras clavel: H. pylori, erradicación, polimorfismo, CYP2C19, CDH1, CDKN2A.
Abstract
Background: Helicobacter pylori (H. pylori), is the main cause of chronic gastritis, peptic ulcers, gastric MALT lymphoma and gastric cancer (GC) (1). International consensus have suggested H. pylori eradication (2-6). However, the effectiveness of first-line triple therapies are less than 80%. In Colombia Trespalacios et al. 2011 reported that the efficacy of triple standard therapy (Proton Pump Inhibitor (PPI) + amoxicillin + clarithromycin) is 71% and 75% with levofloxacin (7). The main cause of therapeutic failures is bacterial resistance (8). Nevertheless, 12.5% of treatments fail even in the absence of bacterial resistance at least in Colombia (7). It could be due to the lack of PPIs efficacy to block gastric acid production, since the pharmacokinetics of PPIs are affected by individual pharmacogenetic factors such as polymorphisms in the cytochrome P450 (CYP) 2C19 enzyme that metabolize PPIs (Lansoprazole, pantoprazole and omeprazole) (9,10,11). Depending on the polymorphism, individuals will metabolize PPIs quickly or slowly and in consequence the acid inhibition capacity will be different in each subject (12). PPIs are essentials in H. pylori eradication therapies since they raise gastric pH and increase the efficacy of acid-sensitive antibiotics such as clarithromycin and amoxicillin (12). Therefore, knowing the distribution of these polymorphisms would allow personalizing therapies. H. pylori eradication has many benefits (13-17), especially in places with a high incidence of GC (18). In Colombia, the incidence of GC for 2018 was 7,419 cases, being the third most prevalent cancer in our country (19), thus without effective prevention measures, its incidence would remain stable or could even increase by 2030 (18). Therefore, achieving effective long-term H. pylori eradication therapy would influence GC prevention (20). However, H. pylori eradication does not guarantee that the gastric mucosa will be completely restored since a "point of no return" has been documented (17), probably related to genetic and epigenetic alterations that H. pylori induces in gastric epithelial cell that accumulate throughout the infectious process (21, 22). Aberrant hypermethylation is the earliest epigenetic event that occurs in chronic gastritis at tumor suppressor genes that coding for cadherin (CDH1) and cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, (CDKN2A), which methylation can reduce their expression leading to dysfunction at the cell-cell and cell cycle junction (15). These epigenetic changes are potentially reversible, so the successful eradication of the microorganism could reverse this process (15). However, currently It continues to be a subject of study in the world.
Objective: To determine CYP2C19 genetic polymorphism effect on H. pylori eradication prospectively and without antibiotic resistance. In addition, to determine if H. pylori eradication eliminates or decreases the methylation in CDH1 and CDKN2A genes, which are considered fundamental epigenetic changes in gastric carcinogenesis during H. pylori infection.
Methods: The influence of CYP2C19 polymorphisms on H. pylori eradication was assessed by a double-blind randomized clinical trial (ClinicalTrials.gov ID: NCT03650543) that included 133 subjects with H. pylori (exclusively) sensitive to amoxicillin and clarithromycin. Antibiotic susceptibility was assessed by dilution on agar. CYP2C19 polymorphisms were determined by qPCR (alleles *1, *2 and *3) (Roche®) and by PCR-RFLP (allele *17). Subjects were randomized into two groups: group 1 received triple standard treatment (amoxicillin, clarithromycin and omeprazole), group 2 received personalized treatment (omeprazole in different doses according to the CYP2C19 genotype with amoxicillin and clarithromycin in standard dose). The verification of H. pylori eradication was performed by (Meridian®) stool antigen test eight weeks post‐treatment.
The influence of H. pylori eradication on CDH1 and CDKN2A methylation was studied in a cohort of 52 successfully treated subjects, followed by 5.5 years and free of H. pylori re-infection. Methylation was assessed before and after H. pylori eradication in DNA pools from antrum and body stomach biopsies. DNA was treated with sodium bisulfite using Ez DNA Methylation Lightning Kit (Zymo®). Methylation was analyzed by Methyligh. ACTB methylation status was used to normalize and calculate the reference methylation percentage (PMR). All results were analyzed with IBM's SPSS Statistics V24, using a statistical significance level of P≤0.05.
Results: The most frequent CYP2C19 genotype was *1/*1 (61.9%), followed by *17/*17 (15.9%), *1/*2 (8.8%), *17/*2 (6.7%) *1/*17 (5.9%) and *2/*2 (0.8%). These findings reflect high frequency of early (67.7%) and ultra-rapid (15.9%) metabolizers of PPI, becoming the first study to describe ultra-rapid metabolizers in Colombia. Triple therapy efficacy with standard omeprazole doses versus personalized therapy based on CYP2C19 polymorphism by ITT analysis was 84% (95% CI: 0.73‐0.91) vs 92.2% (95% CI: 0.82‐0.97) (P=0.14), respectively. The efficacy by PP analysis was 92.1% (95% CI: 0.82‐0.97) vs 100% (95% CI: 0.92‐0.01) (P=0.027), respectively. The observed therapeutic failure occurred in individuals with rapid or ultra-rapid metabolizers who did not receive personalized therapy.
In addition, methylation state of the CDH1 promoter, the promoter and the CDKN2A exon, before eradication methylation was found in 80.8%, 7.7% and 11.5% of the subjects, respectively. After H. pylori eradication, methylation decreased in subjects by 55.7%, 5.7%, and 100%, respectively, finding significant differences for CDH1 (p = 0.049). After H. pylori eradication, the PMR decreased in the gene regions evaluated, being significant in CDH1 after 36 months of follow-up (p = 0.020), and in subjects between 47-59 years (p = 0.020). It was not possible to establish a relationship between the PMR and the gastric atrophy score between OLGA system since it was not reported by the pathologists in all the participants.
Conclusions:
1. The personalized adjustment of omeprazole doses according to the CYP2C19 genotype, proved to be a good strategy to improve the efficacy of the therapies.
2. Successful eradication of H. pylori reverses CDH1 and CDKN2A methylation specially in subjects younger than 50 years and with a follow-up time of more than 60 months.
3. Residual methylation after H. pylori eradication in individuals without histological risk of gastric atrophy (OLGA 0-II) shows that, unlike that suggested by international guidelines, they should be followed over time. This finding demonstrates the usefulness of studying methylation in CHD1 and CDKN2A as possible biomarkers sice it precedes histopathological changes.
4. First western study with the largest number of subjects and longest follow-up time that research aberrant methylation in individuals with mild gastritis before and after the successful eradication of H. pylori.
Keywords: H. pylori, eradication, polymorphism, CYP2C19, CDH1, CDKN2A.
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