Expresión de manganeso peroxidasa en Pichia pastoris X-33 bajo el control del promotor constitutivo GAP

Abstract

El incremento en la contaminación debido al vertimiento de sustancias tóxicas en diferentes cuerpos de agua causado por la industria ha incrementado la preocupación mundial, ya que estos vertimientos representan un riesgo para los ecosistemas, los animales y los humanos, siendo prioridad la búsqueda de soluciones y alternativas. En busca de soluciones se ha recurrido a los sistemas biológicos basados en el uso de microorganismos productores de enzimas con capacidad para degradar una gran variedad de compuestos, entre estos organismos están los hongos de podredumbre blanca que producen enzimas ligninolíticas como la manganeso peroxidasa. Debido a su lento crecimiento y a las condiciones específicas para producirlas se recurre a sistemas de producción heteróloga como Pichia pastoris. En este estudio se realizó la expresión de la enzima recombinante manganeso peroxidasa (E.C. 1.11.1.13) de P. chrysosporium en Pichia pastoris, bajo el control del promotor constitutivo GAP (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa). Para esto se optimizó la secuencia del gen codificante modificando el uso de codones mejorando cambiando el Índice de adaptación de codones (CAI) de 0,54 a 0,97 y se disminuyó el contenido GC a un 40,11% para lograr su expresión en P. pastoris. El gen sintético fue subclonado en pUC57 y transformado en E. coli (JM109) para aumentar la concentración del plásmido recombinante, extraer el gen y clonarlo en el vector de expresión pGAPZαA. El cual más adelante será integrado en el genoma de Pichia pastoris utilizando la técnica de electroporación. Con los clones recombinantes seleccionados se realizarán cinéticas de crecimiento en las que se medirán: actividad enzimática, fuente de carbono residual y se calcularon parámetros cinéticos (velocidad específica de crecimiento, tiempo de duplicación, rendimiento biomasa/sustrato y productividad). Adicionalmente, se realizó una revisión de literatura con respecto a la producción de diferentes proteínas heterólogas en sistemas inducibles y constitutivos especialmente empleando pAOX1 y pGAP y para la expresión de MnPH4. Dicha revisión permitió concluir que usar el promotor GAP puede implicar mayores beneficios, por ejemplo, al no usar metanol como inductor de la expresión, así como más facilidades en su uso, ya que, al ser un promotor constitutivo, que permite la trascripción de manera constante, es posible obtener mejores resultados con respecto a la producción y eficiencia de estas enzimas.