Uso de la enzima ructosiltransferasa de Aspergillus oryzae N74 como parte de un conjugado para cuantificación indirecta de ADN con glucosa como variable de respuesta
Data
2021-06-24Direttore
Alméciga Díaz, Carlos JavierValutatori
Montaña Lara, Jose SalvadorPublishers
Pontificia Universidad Javeriana
facoltà
Facultad de Ciencias
programma
Microbiología Industrial
Titolo ottenuto
Microbiólogo (a) Industrial
Tipo
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado
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Citación
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Titolo inglese
Use of the Fructosiltransferase of Aspergillus oryzae N74 as part of a conjugate for indirect quantification of DNA with glucose as responseSommario
En la búsqueda de técnicas alternativas para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos que presenten soluciones a las limitaciones de las técnicas actuales se plantea un sistema que incluye una reacción de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y una invertasa termoestable liberada durante la reacción produciendo glucosa monómero de fácil cuantificación, permitir la identificación y cuantificación de un fragmento específico de ADN. Este sistema incluyó la generación de un conjugado portando la enzima recombinante fructosiltransferasa (FTasa) de Aspergillus oryzae N74 unida a una nanopartícula magnética mediante fragmentos de ADN complementarios, los cuales, al interactuar con el fragmento de ADN a identificar, permitían la liberación de la enzima. Esta enzima libre, cataliza la hidrólisis de glucosa, la cual puede ser detectada con un método sencillo de cuantificación como la reacción de glucosa Oxidasa/Peroxidasa (BioSystems, Costa Brava, BCN, España) o un glucómetro convencional. Como prueba de concepto, en este trabajo se empleó gen de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS), comúnmente empleado en el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo para investigación del tratamiento de enfermedad de Morquio. Este gen fue detectado y cuantificado inicialmente por PCR en tiempo real (qPCR) a concentraciones entre 0,1 y 5000 ng/µL. Posteriormente, el gen fue detectado y cuantificado empleando el conjugado portando la enzima FTasa. Los resultados mostraron que la amplificación con LAMP es un proceso rápido (35min) que permite la detección de ADN por fluorescencia y cuyo producto de amplificación sirve para integrar el conjugado como método de cuantificación. La unión de una enzima invertasa al conjugado y la construcción de oligonucleótidos específicos para la región blanco permitió establecer una relación directamente proporcional entre la liberación de glucosa y la concentración de ADN entre 0,1 y 1000 ng/µL. La utilización de enzima FTasa recombinante de Aspergillus oryzae N74 permitió realizar la reacción de hidrólisis en concentraciones entre 125 y 1000 mM de sacarosa, siendo 500mM la concentración de sacarosa que mostro una linealidad en la construcción de la curva estándar para la cuantificación. Dado que este método de cuantificación no requiere de equipos sofisticados para su ejecución, se constituye como una herramienta importante para el diseño de métodos de identificación y cuantificación de ácidos nucleicos que puede ser adaptable a laboratorios de investigación y diagnóstico con diferentes grados de complejidad.
Astratto
In the search of novel alternatives for the detection and quantitation of nucleic acids this project proposes a system that involves the amplification of a DNA fragment through a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction and its indirect quantitation by measuring the glucose released by a thermostable invertase. This system involves the generation of a conjugate carrying the recombinant enzyme fructosyltransferase (FTase) from Aspergillus oryzae N74 attached to a magnetic nanoparticle by means of complementary DNA fragments, that after interacted with the target DNA fragment allows the release of the recombinant FTase. The free enzyme catalyzes the hydrolysis of glucose, which can be detected with a simple quantification method such as the glucose oxidase/peroxidase reaction or a conventional glucometer. As proof of concept, this work used the gene for the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS), commonly used at the Institute of Inborn Errors of Metabolism for Morquio's disease research. This gene was initially detected and quantified by real-time PCR (qPCR) at concentrations between 0.1 and 5000 ng/µL. Subsequently, the gene was detected and quantified using the conjugate carrying the FTase enzyme. The results showed that amplification with LAMP allows the detection of DNA by fluorescence and that the amplification product can be integrated to the conjugate for the quantification of the DNA. The binding of an invertase enzyme to the conjugate and the construction of specific oligonucleotides for the target region made it possible to establish a directly proportional relationship between glucose release and DNA concentration between 0.1 and 1000 ng/µL. The use of recombinant FTase enzyme from Aspergillus oryzae N74 allowed the hydrolysis reaction to be carried out in concentrations between 125 and 1000 mM of sucrose, with 500 mM being the concentration that showed the best performance for DNA quantitation. Since this method does not require sophisticated equipment for its execution, it constitutes an important tool for the design of nucleic acid identification and quantitation methods that can be adaptable to research and diagnostic laboratories with different degrees of complexity.
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