Evaluación de la transformación de pentolita solida por bacterias degradadoras de TNT y PETN
Fecha
2020-07-22Autor(es)
Pinilla, GustavoPublicador
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad
Facultad de Ciencias
Programa
Maestría en Ciencias Biológicas
Título obtenido
Magíster en Ciencias Biológicas
Tipo
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Maestría
COAR
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Citación
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Título en inglés
Assessment of the transformation of solid pentolite by TNT and PETN degrading bacteriaResumen
La pentolita es un explosivo sólido ampliamente utilizado en la industria civil y militar
como componente de cargas de detonación, está formado por una mezcla 1:1 de TNT
:PETN que puede llegar a contaminar ambientes como suelos y aguas debido a residuos
del proceso de fabricación y de su posterior uso (p.ej., cargas sin detonar). La exposición
prolongada a la pentolita puede provocar alteraciones a la salud humana ya que el TNT
puede producir cáncer y daño hepático, mientras que el PETN puede producir
afectaciones a las vías respiratorias y problemas cardiacos.
En estudios de laboratorio se ha demostrado que la presencia de TNT inhibe la
biodegradación de PETN en cultivos de enriquecimiento. En muchos ensayos de
transformación de explosivos se utilizan los compuestos disueltos en medio líquido a
bajas concentraciones (~ 100 mg/L) y no hay estudios en la literatura con la pentolita
sólida. Por tanto, en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la
Pontificia Universidad Javeriana, como parte del estudio diseo de un sistema con
microorganismos degradadores de PETN y TNT incorporado en el explosivo pentolita
desarrollado en conjunto con la Universidad de la Salle e INDUMIL, se buscó obtener
bacterias capaces de transformar TNT y PETN, a partir de muestras de suelo
contaminado con explosivos provenientes de la planta INDUMIL, la cual sintetiza PETN
y realiza la mezcla de TNT y PETN. La obtención de bacterias transformadores de
explosivos se realizó en condiciones aerobias con cultivos de enriquecimiento y
biocebos, y en condiciones anaerobias con cultivos de enriquecimiento. En estos se
ensayos se utilizó un medio mínimo mineral (MT2) con explosivo (TNT ó PETN) como
única fuente de nitrógeno (50 mg/L). Se encontraron bacterias (cepas puras) y cultivos
mixtos de bacterias a las que se les evaluó la habilidad de transformar TNT y PETN (100
mg/L) disuelto en medio MT2 líquido y se seleccionaron aquellas que fueron capaces de
transformar el explosivo (>50%). En esta fase del proyecto se obtuvieron en total 9
bacterias y 11 cultivos mixtos (31 bacterias) capaces de transformar TNT, 1 bacteria y
12 cultivos mixtos (30 bacterias) capaces de transformar PETN y 3 bacterias capaces de
transformar pentolita en condiciones anaeróbicas, para un total de 74 bacterias las cuales
fueron identificadas mediante secuenciación del 16S rARN. Con el fin de encontrar la
mejor combinación posible de bacterias y cultivos mixtos, se establecieron 19 consorcios
definidos, con base en los resultados de la caracterización de la transformación por parte
de las bacterias seleccionadas. Se realizo un estudio de transformación de pentolita
sólida por parte de estas bacterias, cultivos mixtos, consorcios definidos y microcosmos
sin inoculo utilizando microcosmos con MT2 enriquecido con una fuente de carbono y
nitrógeno (MT2M). A los microcosmos se le agregaron dos granallas de pentolita
(explosivo sólido), los microcosmos se incubaron a temperatura ambiente (~ 21° C) en
oscuridad sin agitación. La transformación de pentolita se evaluó en el tiempo (~ 2500
días) realizando 6 muestreos por sacrificio (n=3) midiendo la concentración de TNT y
PETN por HPLC, y un recuento microbiano mediante microgota en agar nutritivo. Las
bacterias aisladas de los recuentos en el último evento de muestreo se conservaron a -
80°C en MT2 con glicerol y skim milk. Las bacterias, cultivos mixtos y consorcios
12
definidos capaces de transformar pentolita sólida se seleccionaron con base en la
transformación obtenida al final del estudio y la transformación acumulativa de los
explosivos en el tiempo. En el estudio se observó una transformación más alta del PETN
(21%) que del TNT (18%). Durante el estudio se obtuvieron 3 cultivos mixtos (CMP231,
CMP227 y CMT228), una bacteria (T21) y dos consorcios definidos (C1 y C4) capaces
de transformar pentolita sólida. Se observo una mayor transformación de los explosivos
(19 % TNT, 23 % PETN) en las bacterias y cultivos mixtos que en los consorcios definidos
(17% TNT, 20% PETN), lo cual indica que son mejores a la hora de transformar explosivo
sólido. Se observaron altos recuentos (5 log UFC/mL) de bacterias en los microcosmos,
lo que indica que son capaces de crecer en presencia de pentolita sólida. Los resultados
de la secuenciación del gen 16S rARN de las bacterias encontradas al final del estudio
en estos microcosmos encontraron que pertenecían a los géneros Stenotrophomonas
sp., Citrobacter sp., Pseudomonas sp. y Serratia sp. que en su mayoría no coincidían
con las bacterias inoculadas, lo que podría indicar que las bacterias recuperadas en el
último evento de muestreo corresponden a las que se encuentran en las granallas. La
transformación de explosivos sólidos por parte de los cultivos mixtos seleccionados y las
bacterias encontradas al final del estudio debe ser estudiado en más detalle, sin
embargo, bajo las condiciones de este ensayo logramos determinar la transformación de
pentolita sólida.
Abstract
Pentolite is a solid explosive widely used in civil and military industry as a component of detonation charges, it is made up of a 1: 1 mixture of TNT: PETN that can contaminate environments such as soil and water due to waste the manufacturing process and its subsequent use (e.g., unexploded charges). The exhibition Prolonged to pentolite can cause alterations to human health since TNT can cause cancer and liver damage, while PETN can cause affectations to the respiratory tract and heart problems. In laboratory studies, the presence of TNT has been shown to inhibit the biodegradation of PETN in enrichment cultures. In many essays of transformation of explosives, the compounds dissolved in liquid medium are used to low concentrations (~ 100 mg / L) and there are no studies in the literature with pentolite solid. Therefore, in the Sanitation and Environmental Biotechnology Unit (USBA) of the Pontificia Universidad Javeriana, as part of the study “design of a system with PETN and TNT degrading microorganisms incorporated into the explosive pentolite " developed in conjunction with the Universidad de la Salle and INDUMIL, it sought to obtain bacteria capable of transforming TNT and PETN, from soil samples contaminated with explosives from the INDUMIL plant, which synthesizes PETN and performs the mixing of TNT and PETN. Obtaining transforming bacteria from explosives was performed under aerobic conditions with enrichment cultures and bio-baits, and under anaerobic conditions with enrichment cultures. In these are In the tests, a minimal mineral medium (MT2) with explosive (TNT or PETN) was used as sole nitrogen source (50 mg / L). Bacteria (pure strains) and cultures were found mixed bacteria that were evaluated for the ability to transform TNT and PETN (100 mg / L) dissolved in liquid MT2 medium and those that were capable of transform the explosive (> 50%). In this phase of the project, a total of 9 bacteria and 11 mixed cultures (31 bacteria) capable of transforming TNT, 1 bacterium and 12 mixed cultures (30 bacteria) capable of transforming PETN and 3 bacteria capable of transform pentolite under anaerobic conditions, for a total of 74 bacteria which were identified by 16S rRNA sequencing. To find the best possible combination of bacteria and mixed cultures, 19 consortia were established defined, based on the results of the characterization of the transformation by of the selected bacteria. A pentolite transformation study was carried out solid by these bacteria, mixed cultures, defined consortia and microcosm without inoculum using microcosm with MT2 enriched with a carbon source and nitrogen (MT2M). Two pentolite granules were added to the microcosm (solid explosive), the microcosms were incubated at room temperature (~ 21 ° C) in darkness without agitation. The pentolite transformation was evaluated over time (~ 2500 days) performing 6 samplings per sacrifice (n = 3) measuring the concentration of TNT and PETN by HPLC, and a microbial count by microdroplet on nutrient agar. The Bacteria isolated from counts at the last sampling event were conserved at - 80 ° C in MT2 with glycerol and skim milk. Bacteria, mixed cultures, and consortia 12 defined capable of transforming solid pentolite were selected based on the transformation obtained at the end of the study and the cumulative transformation of the explosives in time. Higher transformation of PETN was observed in the study (21%) than TNT (18%). During the study, 3 mixed cultures were obtained (CMP231, CMP227 and CMT228), one bacterium (T21) and two defined consortia (C1 and C4) capable to transform solid pentolite. A greater transformation of explosives was observed (19% TNT, 23% PETN) in bacteria and mixed cultures than in defined consortia (17% TNT, 20% PETN), which indicates that they are better at transforming explosives solid. High counts (5 log CFU / mL) of bacteria were observed in the microcosm, which indicates that they are capable of growing in the presence of solid pentolite. The results of the 16S rRNA gene sequencing of the bacteria found at the end of the study in these microcosms they found that they belonged to the genera Stenotrophomonas sp., Citrobacter sp., Pseudomonas sp. and Serratia sp. that mostly did not match with the inoculated bacteria, which could indicate that the bacteria recovered in the last sampling event correspond to those found in the shot. The transformation of solid explosives by selected mixed cultures and bacteria found at the end of the study should be studied in more detail, without However, under the conditions of this test we were able to determine the transformation of solid pentolite.
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