Caracterización de un banco de cepas de levaduras nativas para la identificación de un nuevo sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes

Abstract

Las levaduras son microorganismos ampliamente utilizados en la producción de proteínas recombinantes debido a las ventajas que presenta este sistema. Sin embargo, es importante identificar nuevos sistemas de expresión que permitan obtener mayores rendimientos y/o proteínas con mejores propiedades de estabilidad o actividad. El presente trabajo tuvo como fin caracterizar un banco de cepas nativas e identificar un nuevo sistema de expresión de proteínas recombinantes. Para la identificación de las levaduras se utilizaron métodos convencionales y moleculares. API 20C Aux mostró porcentajes de identificación con porcentajes entre el 81-99% y el MALDI-TOF de 1.86 – 2.17. Mediante los resultados obtenidos se seleccionaron dos levaduras para la producción de proteínas heterólogas: S. cerevisiae y W. anomalus; igualmente su cinética de crecimiento en fuentes como: glucosa 2%, sacarosa 2%, metanol 0,5% o glicerol% mostraron mayores velocidades de crecimiento y menor tiempo de duplicación a diferencia de las demás cepas. En S. cerevisiae se presentó un µx de 0,27 h-1 en sacarosa, y en glicerol y metanol, se presentó un comportamiento similar con un valor de 0,1 h-1 . W. anomalus presentó un µx de 0,3 h-1 tanto en glucosa como sacarosa y de 0,1 h-1 en metanol y glicerol. Posteriormente se realizó una confirmación para la identificación de W. anomalus mediante la amplificación de un fragmento del ITS, los resultados permitieron confirmar los resultados obtenidos para esta cepa empleando MALDI-TOF y API. Finalmente, estos microorganismos se transformaron con plásmidos conteniendo los genes de las enzimas celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91) o β- glucosidasa (E.C.3.2.1.21), se observó que independiente del método utilizado para la transformación con S. cerevisae no se obtuvieron colonias transformantes, sin embargo con W. anomalus se obtuvieron clones de ambos plásmidos. Con el fin de evaluar la expresión de la enzima se realizaron cultivos a pequeña escala observando que la levadura nativa W. anomalus produce la enzima β- glucosidasa de forma endógena por lo que los clones evaluados fueron descartados debido a que la expresión de estos no superaron a los valores del blanco; por otro lado se observó actividad celobiohidrolasa de 5.65 U/L a la hora 96 de cultivo en uno de los clones, lo cual se contrasta con trabajos previos con otras levaduras en los que no se ha observado actividad para esta enzima recombinante. En el presente estudio se demostró que los tres métodos de identificación permitieron la edificación de una nueva cepa y se muestra por primera vez el uso de la levadura W. anomalus como sistema para la producción de proteínas recombinantes.