Evaluación de la enzima alfa-N-acetilglucosaminidasa humana recombinante obtenida en Komagataella phaffii GS115 en un modelo in vitro de fibroblastos MPS IIIB
Datum
2021-11-03Autoren
Triana Rojas, Heidy YohanaHerausgeber
Pontificia Universidad Javeriana
Fakultät
Facultad de Ciencias
Programm
Maestría en Ciencias Biológicas
Erhaltener Titel
Magíster en Ciencias Biológicas
Typ
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Maestría
COAR
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Englischer Titel
Evaluation of the recombinant human alpha-N-acetylglucosaminidase enzyme obtained from Komagataella phaffii GS115 in an in vitro model of MPS IIIB fibroblastsZusammenfassung
La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS IIIB), o síndrome de Sanfilippo tipo B, es un trastorno de almacenamiento lisosomal autosómico recesivo causado por deficiencia en la actividad de la enzima lisosomal α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU), provocando la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato (HS). Los pacientes que padecen esta enfermedad presentan principalmente alteraciones a nivel del sistema nervioso central, además de anomalías en otros órganos y tejidos. Actualmente, no existen terapias aprobadas para este trastorno, por lo que diferentes alternativas terapéuticas están siendo evaluadas. La terapia de reemplazo enzimático (TRE) permite la reducción de los sustratos acumulados en el lisosoma a través del suministro de proteínas recombinantes producidas en diferentes sistemas de expresión. La TRE ha sido aprobada para 11 enfermedades lisosomales, para las cuales se han utilizado sistemas de expresión como células de mamífero, plantas y animales. A la fecha, la enzima NAGLU recombinante solo ha sido producida de forma exitosa en células de ovario de hámster chino (CHO). Para el caso de microorganismos como las levaduras aún no se ha obtenido esta enzima recombinante de forma activa empleando este sistema de expresión. Sin embargo, este sistema de expresión ha sido ampliamente usado para la expresión de proteínas de origen humano para terapia, debido a que presenta ventajas como su fácil manipulación y bajo costo de producción, su capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a la proteína nativa humana y la posibilidad de obtener la proteína de forma extracelular, lo cual favorece los procesos de purificación. En el presente estudio se evaluó la producción de la enzima NAGLU recombinante en la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (Pichia pastoris) GS115 como sistema de expresión. La cepa fue transformada con el vector pPICZαA-NAGLU, el cual permite la expresión del gen NAGLU bajo el control del promotor AOX1. La presencia del inserto fue verificada por PCR en diez clones obtenidos en medio suplementado con zeocina. La expresión de la proteína recombinante fue inicialmente evaluada a escala de 10 mL, y aquellos clones que presentaron mayor actividad fueron usados para producir la proteína a escala de 100 mL, escala en la cual dos clones mostraron valores de actividad de 0,074 U/mL y 0,121 U/mL después de 72 horas de inducción. El clon con mejor actividad a 100 mL fue escalado a 400 mL mostrando una actividad de 0,187 U/mL a las 72 horas de cultivo. Finalmente, el extracto crudo fue clarificado a través de diferentes poros de membrana, concentrado y diafiltrado para ser purificado por medio de cromatografía de afinidad. Las fracciones recolectadas mostraron actividades entre 0,195 – 0,242 U/mL, y la presencia de la proteína fue verificada mediante SDS-PAGE y western-blot. Las fracciones fueron desalinizadas, concentradas y diafiltradas en citrato de sodio obteniendo una actividad específica de 0,438 U/mg. Posteriormente, la enzima recombinante NAGLU purificada se usó para realizar ensayos in-vitro empleando fibroblastos de pacientes MPS IIIB. Los resultados mostraron que la proteína fue capturada en un proceso mediado por receptores manosa y manosa-6-fosfato, permitiendo la reducción de la masa lisosomal. Estos resultados representan la primera evidencia de la posibilidad de emplear la levadura K. phaffii como sistema de expresión para la producción de NAGLU humana recombinante, como potencial herramienta para el estudio y continuo desarrollo de una TRE para pacientes con MPS IIIB.
Abstrakt
Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPS IIIB), or Sanfilippo syndrome type B, is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by a deficiency in the activity of the lysosomal enzyme α-N-acetylglucosaminidase (NAGLU), causing the accumulation of glycosaminoglycan heparan sulfate. (HS). Patients with this disease mainly present alterations in the central nervous system, in addition to abnormalities in other organs and tissues. Currently, there are no approved therapies for this disorder, so different therapeutic alternatives are being evaluated. Enzyme replacement therapy (ERT) allows the reduction of accumulated substrates in the lysosome through the delivery of recombinant proteins produced in different expression systems. ERT has been approved for 11 lysosomal diseases, for which expression systems such as mammalian cells, plants and animals have been used. To date, the recombinant NAGLU enzyme has only been successfully produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. In the case of microorganisms such as yeast, this recombinant enzyme has not yet been actively obtained using this expression system. However, this expression system has been widely used for the expression of proteins of human origin for therapy, due to the fact that it has advantages such as its easy manipulation and low production cost, its ability to carry out post-translational modifications similar to the native human protein and the possibility of obtaining the protein extracellularly, which favors purification processes. In the present study, the production of the recombinant NAGLU enzyme was evaluated in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris) GS115 as an expression system. The strain was transformed with the vector pPICZαA-NAGLU, which allows the expression of the NAGLU gene under the control of the AOX1 promoter. The presence of the insert was verified by PCR in ten clones obtained in medium supplemented with zeocin. The expression of the recombinant protein was initially evaluated at a 10 mL scale, and those clones that presented higher activity were used to produce the protein at a 100 mL scale, a scale in which two clones showed activity values of 0.074 U / mL and 0.121 U / mL after 72 hours of induction. The clone with the best activity at 100 mL was scaled to 400 mL showing an activity of 0.187 U / mL at 72 hours of culture. Finally, the crude extract was clarified through different membrane pores, concentrated and diafiltered to be purified by means of affinity chromatography. The collected fractions showed activities between 0.195 - 0.242 U / mL, and the presence of the protein was verified by SDS-PAGE and western-blot. The fractions were desalted, concentrated and diafiltered in sodium citrate obtaining a specific activity of 0.438 U / mg. Subsequently, the purified recombinant enzyme NAGLU was used for in-vitro assays using fibroblasts from MPS IIIB patients. The results showed that the protein was captured in a process mediated by mannose and mannose-6-phosphate receptors, allowing the reduction of the lysosomal mass. These results represent the first evidence of the possibility of using the yeast K. phaffii as an expression system for the production of recombinant human NAGLU, as a potential tool for the study and continuous development of an ERT for patients with MPS IIIB.
Schlüsselwörter
Sanfilippo IIIBProteína recombinante
Terapia de reemplazo enzimático
Fibroblastos
Endocitosis
Komagataella phaffii GS115
Keywords
Sanfilippo IIIBRecombinant protein
Enzyme replacement therapy
Fibroblasts
Endocytosis
Komagataella phaffii GS115
Themen
Maestría en ciencias biológicas - Tesis y disertaciones académicasProteínas recombinantes
Fibroblastos
Endocitosis
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