Evaluación de aptámeros con afinidad por receptores de barrera hematoencefálica conjugados a la enzima Alfa-N-acetilglucosaminidasa
Fecha
2021-12-07Autor(es)
Ordóñez Rojas, AndrésDirector(es)
Alméciga Díaz, Carlos JavierPublicador
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad
Facultad de Ciencias
Programa
Microbiología Industrial
Título obtenido
Microbiólogo (a) Industrial
Tipo
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado
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Citación
Documentos PDF
Título en inglés
Evaluation of aptamers with affinity for blood-brain barrier receptors conjugated to the enzyme Alpha-N-acetylglucosaminidaseResumen
La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS III), también llamada síndrome de Sanfilippo tipo B, es un desorden de depósito lisosomal que causa una degeneración sistémica, afectando en gran medida el sistema nervioso central (SNC). La deficiencia enzimática en esta enfermedad es causada por mutaciones en el gen NAGLU, el cual codifica para la enzima alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU, EC: 3.2.1.50), una de las cuatro enzimas encargadas de la degradación del heparán sulfato (HS), provocando su acumulación en lisosoma. Como modelo de tratamiento, se ha propuesto la terapia de reemplazo enzimático (TRE) que permite la reducción del sustrato acumulado a través del suministro de proteínas recombinantes. Este modelo de terapia ha sido aprobado para 11 enfermedades lisosomales.
La enzima NAGLU recombinante ha sido producida de forma exitosa en células de ovario de hámster chino (CHO) y recientemente, en nuestro laboratorio usando la levadura Komagataella phaffii GS115 como sistema de expresión. La primera aproximación reveló que la proteína producida era pobre en residuos de manosa-6-fosfato (M6P), esto se tradujo en una limitada captación celular. En el caso de la proteína producida en K. phaffii, a pesar que no se tiene la información detallada del perfil de glicosilación para esta proteína recombinante, se ha demostrado que es internalizada por las células y reduce la masa lisosomal en células de pacientes MPSIIIB. Sin embargo, teniendo en cuenta que la mayor dificultad del uso de esta proteína recombinante en una TRE de administración intravenosa sería su paso a través de la barrera hematoencefálica (BHE), este trabajo propone el uso de aptámeros, ácidos nucleicos capaces de reconocer dianas específicas, como una estrategia para dicho propósito. Inicialmente se identificaron 10 aptámeros como posibles aptámeros candidatos a cruzar la BHE y a partir de estos se seleccionaron: TfRA4, aptámero que reconoce el receptor de transferrina humana; GL21.T, aptámero que reconoce el receptor de tirosin quinasa Axl; y RNV-L17, aptámero que reconoce el receptor de LDL humano. Luego de obtener los modelos 3D de estos tres aptámeros y hacer la conjugación a NAGLU, se hicieron estudios de docking para evaluar los cambios en la afinidad de la proteína por los sustratos HS y 4-metilumbeliferil-2-acetamida-2-desoxi-alfa-D-glucopiranósido (4MUG). Dichos resultados sugirieron diferencias en la interacción de los aminoácidos circundantes al sitio activo y diferencias pequeñas en la afinidad de la enzima por los sustratos. Adicionalmente, se realizó el modelamiento de la interacción de los conjugados con sus respectivos receptores, prediciendo que la conjugación de los aptámeros con la enzima NAGLU podría disminuir la afinidad de los aptámeros por su receptor. Finalmente, se realizó la producción de la proteína NAGLU recombinante a escala de 400 mL durante 72 h. El extracto crudo presentó una actividad específica inicial de 2,53 U/mg, el cual fue usado para realizar la conjugación con TFRA4. Al final del proceso de conjugación, la actividad específica se redujo a 0,36 U/mg. La verificación de la conjugación fue realizada mediante espectrofotometría donde la relación 260/280 del conjugado tuvo un valor de 1,19; mientras que la del control negativo de conjugación tuvo un valor de 1,16, valores que no permitieron concluir sobre si la conjugación fue exitosa o no. Estos resultados sirven como línea base para futuros experimentos donde se planteen las condiciones de conjugación apropiadas que lleven a que la proteína no se vea afectada. Ahora bien, los esfuerzos por purificar la proteína deben continuar para así tener certeza sobre el efecto que tiene la conjugación de los aptámeros sobre la actividad enzimática de NAGLU.
Abstract
ucopolysaccharidosis IIIB (MPSIIIB), or Sanfilippo syndrome type B, is an autosomal recessive lysosomal storage disease caused by catalytic deficiency of the enzyme α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU, EC: 3.2.1.50). Such deficiency causes accumulation of the glycosaminoglycan heparan sulfate (HS) within the lysosome. In patients, central nervous system impairment predominates in addition to abnormalities peripheral organs and tissues. At present, there is no therapy approved for this disease. Enzyme replacement therapy (ERT) has been proposed as a model of therapy which allows the reduction of the substrate accumulated in the lysosome through the delivery of recombinant enzymes. This therapy model has been approved for 11 lysosomal diseases, by using enzymes produced in mammalian, plant, and chicken´s eggs expression systems.
The recombinant NAGLU enzyme has been successfully produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells and recently, in our laboratory using the yeast Komagataella phaffii as an expression system. The first approach revealed that the protein produced was poor in mannose-6-phosphate (M6P) residues, which resulted in limited cellular uptake. In the case of the protein produced in K. phaffii, detailed information on the post-translational profile is not available, but a reduction in the lysosomal mass of MPSIIB patients was evidenced in addition to a cell uptake. However, since the major problem associated with this disease is the crossing through the blood-brain barrier, this work proposes the use of aptamers, nucleic acids capable of recognizing specific targets, as a strategy for such crossing.
Initially, potential aptamer candidates to cross the blood-brain barrier were identified, among which the following were selected: TfRA4, an aptamer that recognizes the human transferrin receptor; GL21.T, an aptamer that recognizes the Axl tyrosine kinase receptor; and RNV-L17, an aptamer that recognizes the human LDL receptor. After obtaining the 3D models of the aptamers and making the conjugation to NAGLU, docking studies were performed to evaluate the changes in the affinity of the protein for the substrates HS and 4-methylumbelliferyl-2-acetamide-2-desoxy-alpha-D-glucopyranoside (4MUG). These results predicted differences in the interaction of amino acids surrounding the active site, resulting in minimal differences in the affinity of the enzyme for the substrates. Later, it was predicted the interaction of conjugated aptamers with their receptors, suggestion that NAGLU conjugation may impair the receptor-aptamer interaction. Subsequently, an attempt was made to produce the protein in the laboratory at a 400 mL scale for 72 h and then conjugate it to TFRA4. At the end of the conjugation process, the specific activity was reduced to 0.36 U / mg. Verification of the conjugation was carried out by spectrophotometry where the 260/280 ratio of the conjugate had a value of 1.19; while that of the negative control of conjugation had a value of 1.16, values that did not allow to conclude on whether the conjugation was successful or not. These results serve as a baseline for future experiments where the appropriate conjugation conditions are proposed that lead to the protein being unaffected. However, efforts to purify the protein must continue in order to be certain about the effect that conjugation of aptamers has on the enzymatic activity of NAGLU.
Palabras clave
MucopolisacaridosisKeywords
MucopolysaccharidosisTemas
Microbiología industrial - Tesis y disertaciones académicasMucopolisacaridosis III - microbiología
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Mucopolisacaridosis III - enzimología
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