Evaluación de aptámeros con afinidad por receptores de barrera hematoencefálica conjugados a la enzima Alfa-N-acetilglucosaminidasa

Abstract

La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS III), también llamada síndrome de Sanfilippo tipo B, es un desorden de depósito lisosomal que causa una degeneración sistémica, afectando en gran medida el sistema nervioso central (SNC). La deficiencia enzimática en esta enfermedad es causada por mutaciones en el gen NAGLU, el cual codifica para la enzima alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU, EC: 3.2.1.50), una de las cuatro enzimas encargadas de la degradación del heparán sulfato (HS), provocando su acumulación en lisosoma. Como modelo de tratamiento, se ha propuesto la terapia de reemplazo enzimático (TRE) que permite la reducción del sustrato acumulado a través del suministro de proteínas recombinantes. Este modelo de terapia ha sido aprobado para 11 enfermedades lisosomales.

La enzima NAGLU recombinante ha sido producida de forma exitosa en células de ovario de hámster chino (CHO) y recientemente, en nuestro laboratorio usando la levadura Komagataella phaffii GS115 como sistema de expresión. La primera aproximación reveló que la proteína producida era pobre en residuos de manosa-6-fosfato (M6P), esto se tradujo en una limitada captación celular. En el caso de la proteína producida en K. phaffii, a pesar que no se tiene la información detallada del perfil de glicosilación para esta proteína recombinante, se ha demostrado que es internalizada por las células y reduce la masa lisosomal en células de pacientes MPSIIIB. Sin embargo, teniendo en cuenta que la mayor dificultad del uso de esta proteína recombinante en una TRE de administración intravenosa sería su paso a través de la barrera hematoencefálica (BHE), este trabajo propone el uso de aptámeros, ácidos nucleicos capaces de reconocer dianas específicas, como una estrategia para dicho propósito. Inicialmente se identificaron 10 aptámeros como posibles aptámeros candidatos a cruzar la BHE y a partir de estos se seleccionaron: TfRA4, aptámero que reconoce el receptor de transferrina humana; GL21.T, aptámero que reconoce el receptor de tirosin quinasa Axl; y RNV-L17, aptámero que reconoce el receptor de LDL humano. Luego de obtener los modelos 3D de estos tres aptámeros y hacer la conjugación a NAGLU, se hicieron estudios de docking para evaluar los cambios en la afinidad de la proteína por los sustratos HS y 4-metilumbeliferil-2-acetamida-2-desoxi-alfa-D-glucopiranósido (4MUG). Dichos resultados sugirieron diferencias en la interacción de los aminoácidos circundantes al sitio activo y diferencias pequeñas en la afinidad de la enzima por los sustratos. Adicionalmente, se realizó el modelamiento de la interacción de los conjugados con sus respectivos receptores, prediciendo que la conjugación de los aptámeros con la enzima NAGLU podría disminuir la afinidad de los aptámeros por su receptor. Finalmente, se realizó la producción de la proteína NAGLU recombinante a escala de 400 mL durante 72 h. El extracto crudo presentó una actividad específica inicial de 2,53 U/mg, el cual fue usado para realizar la conjugación con TFRA4. Al final del proceso de conjugación, la actividad específica se redujo a 0,36 U/mg. La verificación de la conjugación fue realizada mediante espectrofotometría donde la relación 260/280 del conjugado tuvo un valor de 1,19; mientras que la del control negativo de conjugación tuvo un valor de 1,16, valores que no permitieron concluir sobre si la conjugación fue exitosa o no. Estos resultados sirven como línea base para futuros experimentos donde se planteen las condiciones de conjugación apropiadas que lleven a que la proteína no se vea afectada. Ahora bien, los esfuerzos por purificar la proteína deben continuar para así tener certeza sobre el efecto que tiene la conjugación de los aptámeros sobre la actividad enzimática de NAGLU.