Evaluación in vitro del sistema de edición genómica CRISPR/nCas9 en fibroblastos de pacientes con mucopolisacaridosis IIIB como posible estrategia de tratamiento
Fecha
2022-06-08Autor(es)
Lemaitre Gómez, PalomaEvaluador(es)
Rodríguez Arias, Edwin AlexanderPublicador
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad
Facultad de Ciencias
Programa
Microbiología Industrial
Título obtenido
Microbiólogo (a) Industrial
Tipo
Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado
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Citación
Documentos PDF
Título en inglés
In vitro evaluation of the CRISPR/nCas9 genomic editing system in fibroblasts of patients with mucopolysaccharidosis IIIB as a possible treatment strategyResumen
La mucopolisacaridosis IIIB (MPS IIIB) es una enfermedad de depósito lisosomal (EDL) que se caracteriza por la deficiencia de la enzima α–N-acetilglucosaminidasa causada por mutaciones en el gen NAGLU. La deficiencia de esta enzima lisosomal genera la acumulación de glicosaminoglicanos (GAGs), específicamente de heparán sulfato (HS) tanto en los lisosomas como a nivel extracelular, lo que causa distintas afecciones clínicas con particular compromiso del sistema nervioso central (SNC). A la fecha, no hay una terapia aprobada para el tratamiento de la MPS IIIB, sin embargo, la edición génica con CRISPR/nCas9 y vectores no virales como mecanismo de entrega de genes surge como una alternativa de tratamiento que ha mostrado resultados alentadores en otros tipos de EDL como la gangliosidosis GM2 y MPS IVA. En este sentido, en el presente estudio se evaluó por primera vez en un modelo in vitro el uso de la herramienta de edición genómica CRISPR/nCas9 para generar el knock-in de un casete de expresión que contiene el ADNc de NAGLU en el locus AAVS1 del genoma humano. Los resultados mostraron una construcción exitosa de un vector donante con el ADNc de NAGLU. Luego de 30 días de edición, se alcanzó hasta un 71% de la actividad normal de NAGLU. Adicionalmente, se observó una tendencia a la disminución de la masa lisosomal promedio a los 30 días post-transfección, aunque no en la cantidad de GAGs totales. Estos resultados sirven como base para futuros experimentos que permitan sumar al conocimiento sobre los beneficios, ventajas y riesgos de la utilización de CRISPR/nCas9 como nueva alternativa de terapia génica para la MPS IIIB.
Abstract
Mucopolysaccharidosis IIIB (MPS IIIB) is a lysosomal storage disease (LSD) characterized by the deficiency of the α-N-acetylglucosaminidase enzyme caused by mutations in the gene encoding for it. The deficiency of this lysosomal enzyme generates the accumulation of glycosaminoglycans (GAGs), especially heparan sulfate (HS) in the lysosomes of the cell as well as extracellularly, which causes different clinical conditions mainly affecting the central nervous system (CNS). To date, there is no approved therapy for the treatment of MPS IIIB, however, gene editing with CRISPR/nCas9 and non-viral vectors as a gene delivery mechanism arises as a treatment model alternative that has shown encouraging results in other types of LSD such as GM2 gangliosidoses and MPS IVA. In this sense, in the present study the use of the genomic editing tool CRISPR/nCas9 for the expression of a cassette with NAGLU cDNA at the AAVS1 locus of the human genome was evaluated for the first time in an in vitro model. The results showed a successful recombination and construction of a donor vector with NAGLU cDNA, and an increase in long-term enzyme activity (30 days) reaching values of 71% of normal NAGLU activity. Additionally, a decrease in the average lysosomal mass was observed within 30 days post-transfection, but not in total GAGs. These results serve as a basis for future experiments that sum up to the actual information about the benefits, advantages, and risks of using CRISPR/nCas9 as a new gene therapy alternative for MPS IIIB.
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Microbiología industrial - Tesis y disertaciones académicasTerapia de gen - Bogotá (Colombia)
Mucopolisacaridosis
Genómica
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