CRISPR-nCas9 como posible terapia génica para la enfermedad de Tay-Sachs mediante el uso del polímero PP6D5 como sistema de entrega

Abstract

La enfermedad de Tay-Sachs (TSD) es un error innato del metabolismo clasificado como una enfermedad neurodegenerativa de depósito lisosomal, causada por mutaciones en el gen HEXA que codifica la enzima β- hexosaminidasa A. Esta disfunción provoca un aumento de gangliósidos GM2 en el lisosoma y consecuentemente aglomeración de estos en distintos sitios de la célula al no ser degradados, afectando principalmente el sistema nervioso central. Actualmente, no existe un tratamiento aprobado para detener la progresión de la enfermedad, pero en los últimos años se han trabajado distintas estrategias terapéuticas como chaperonas farmacológicas, terapia de reducción de sustrato, trasplante de células madre hematopoyéticas, terapia de sustitución enzimática y terapia génica. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha venido trabajando en la evaluación de un sistema CRISPR-Cas9 nicasa (nCas9), para el desarrollo de un tratamiento para TSD y otras enfermedades lisosomales. Sin embargo, los resultados previos han mostrado la necesidad de buscar nuevos vectores que permitan mejorar los resultados obtenidos previamente. Por lo tanto, este proyecto tuvo como objetivo evaluar el efecto de la herramienta genómica CRISPR-nCas9 en la expresión de la enzima HexA y la eficiencia de transfección en modelos celulares de origen murino y humano como potencial modelo para el tratamiento de TSD. Para ello, se utilizaron dos vectores no virales con el fin de determinar si el polímero PP6D5 tiene un mejor sistema de entrega que la lipofectamina 3000. Se evaluó la citotoxicidad del polímero en fibroblastos 3T3, astrocitoma U87MG y neuroblastoma SHSY5Y. Adicionalmente, se obtuvo la eficiencia de transfección y actividad enzimática con los dos vectores utilizando 3 plásmidos para entrega (donante HexA y HexB, y CRISPR-nCas9). Los resultados mostraron en la prueba de citotoxicidad que los astrocitoma y neuroblastoma son más sensibles al polímero que los fibroblastos. Adicionalmente, el polímero PP6D5 tuvo mayor eficiencia de transfección en los tres modelos celulares con 16,06% para 3T3, 28,05% para U87MG y 32,85% para SHSY5Y en comparación con la lipofectamina 3000. La actividad enzimática con MUGS en fibroblastos tratados con lipofectamina y polímero 5 N/P, presentó un incremento a los 30 días post- transfección, mientras que para el polímero 10 N/P no presentó actividad. En la línea de astrocitoma, la lipofectamina presentó mayor actividad que el polímero 5 N/P durante los días evaluados. Finalmente, en la línea de neuroblastoma hubo aumento de la actividad empleando la lipofectamina con los plásmidos a los 7 días de transfección. La actividad enzimática con MUG presentó mayor actividad para HexB que HexA en las transfecciones con el vector y los tres plásmidos en fibroblastos y neuroblastoma. Para los astrocitoma, hay mayor actividad de HexA en células transfectadas con lipofectamina y el polímero a una relación 5 N/P, en compasión con sus respectivos controles. En conclusión, el polímero como sistema de entrega muestra mayor eficiencia de transfección que la lipofectamina a las 48 horas, sin embargo, hay mucha variabilidad de la actividad enzimática a los diferentes días post-transfección lo cual requiere de más investigación tomando en cuenta un mayor número de réplicas si es posible y transfectando un plásmido donante (HexA) en vez de dos.