Evaluación de polímero anfifílico como agente de transfección no viral en fibroblastos de pacientes con Mucopolisacaridosis IIIB en un sistema de terapia génica empleado la herramienta CRISPR/Cas9

Abstract

Los errores innatos del metabolismo son un grupo de enfermedades en su mayoría causados por deficiencias enzimáticas, en el caso de la mucopolisacaridosis IIIB la deficiencia de la α–N-acetilglucosaminidasa, genera la acumulación lisosomal de azúcares complejos como los glicosaminoglicanos, especialmente del heparán sulfato, como consecuencia se generan fallos en el funcionamiento celular y deficiencias sistémicas generalizadas, teniendo las mayores repercusiones en el sistema nervioso central. Actualmente no se dispone de una terapia aprobada para esta enfermedad, como respuesta, la herramienta CRISPR/cas9 se presenta como una alternativa prometedora, sin embargo, los mecanismos de transfección génica tradicionales como la lipofección limitan el estudio, desarrollo e implementación de nuevas estrategias debido a sus elevados costos y a su baja biocompatibilidad celular, motivo por el cual el presente estudió tiene como objetivo evaluar la citotoxicidad y eficiencia de transfección del polímero no lineal PP6D5 diseñado y producido por el Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, como mecanismo de transfección no viral en un modelo In-vitro de terapia génica empleando la herramienta CRISPR/Cas9. En primera instancia la purificación del polímero se realizó mediante diálisis, adicionalmente, los ensayos celulares se realizaron en el laboratorio del Instituto de Errores Innatos del Metabolismo de Bogotá, ubicado en la Pontificia Universidad Javeriana, las líneas celulares empleadas incluyeron fibroblastos Wild Type (GM006139) , fibroblastos de pacientes con mucopolisacaridosis IIIB (GM002931) y células HEK293. Los ensayos de viabilidad celular se realizaron empleando el ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5,-difenil tetrazolio , donde la concentración inhibitoria para la línea celular HEK 293 fue de 1,029mM y para la línea de fibroblastos WT GM006139 fue de 0,9688 mM, la concentración empleada en los ensayos correspondió a 0,1282nM donde el porcentaje de supervivencia fue del 100%, en cuanto a los vectores de transfección empleados en el estudio, indicando así su alto nivel de biocompatibilidad. Por otra parte, el plásmido con el sistema CRISPR/nCas9 fue construido previamente por el Estudiante de Doctorado Andrés Leal, en cuanto al vector donante de la secuencia NAGLU bajo el promotor del citomegalovirus (CMV) y flanqueado por brazos de recombinación para el locus AAVS1 fue construido por la estudiante de pregrado Paloma Lemaite, ambos pertenecientes al Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, finalmente el vector con la secuencia codificante para la enzima lisosomal NAGLU fue donado por la doctora Michelina Lacovino, perteneciente al Lundquist Institute Harbor-UCLA Medical Center en Estados Unidos. El porcentaje de transfección para la líneas celulares empleadas fue medido mediante citometría de flujo, donde para la línea HEK293 se obtuvo un porcentaje de 23,4% ± 4,24 empleando Lipofectamina, y de 17,4% ± 0,28 con el polímero PP6D5, por otro lado, en el caso de los fibroblastos WT se se obtuvo un porcentaje de 10,1 % ± 1,4 empleando Lipofectamina, y de 9,2 % ± 0,021 con el polímero PP6D5. En cuanto a la variación de la actividad enzimática específica de NAGLU en células HEK293 posterior a la transfección con ambos métodos, se obtuvieron 2,8 veces de cambio con respecto al control empleando el polímero versus las 1,39 veces de cambio correspondientes la lipofectamina, lo cual sugiere que el porcentaje de transfección no es directamente proporcional al cambio en la actividad enzimática. Para los 3 montajes de edición génica realizados, se encontraron actividades enzimáticas promedio de 3,6 U/mg (27 días), 1,5 U/mg (10 días ) y 1,6 U/mg (4 días) empleando como vector de transfección la lipofectamina 300, por otro lado, se obtuvieron los siguientes resultados al emplear como vector el polímero PP6D5 4,4U/mg (27 días), 1,9 U/mg (10 días ) y 2U/mg (4 días), presentándose una variación significativa entre los datos control y los datos reportados a los 27 días, lo cual es indicativo preliminar de la inserción satisfactoria de la secuencia NAGLU, los ensayos de variación de actividad enzimática fueron cuantificados mediante fluorescencia. Finalmente ​​el análisis estadístico realizado a los datos de glucosaminoglicanos liberados al medio evidenció que no hay una diferencia significativa entre los medios provenientes los fibroblastos de pacientes con MPS III B tratadas con el sistema de edición genética y los fibroblastos WT.