Evaluación de las condiciones de reacción para para la medición de la actividad lacasa de la enzima recombinante POXA 1B de Pleurotus ostreatus

Abstract

Las lacasas son glicoproteínas que han generado un gran interés a nivel biotecnológico debido a sus aplicaciones potenciales en diversos campos. Estas enzimas oxidan compuestos aromáticos con la subsecuente reducción del oxígeno molecular a agua. La medición de la actividad enzimática varía para cada lacasa dependiendo del origen, de los diferentes sustratos, buffers o condiciones usadas durante la reacción. Esta medición es utilizada para evidenciar la producción y funcionamiento de la lacasa, por lo que en este trabajo se determinaron las mejores condiciones de reacción para la medición de la actividad enzimática de la lacasa recombinante POXA 1B (rPOXA 1B) de Pleurotus ostreatus expresada en Pichia pastoris. Se realizaron dos “Optimal Designs” con los buffer acetato y citrato con los que se evaluaron diferentes pH, concentraciones de ABTS y longitudes de onda para la medición de la actividad lacasa. La mejor combinación, se utilizó para conocer la cinética de la enzima concentrada y determinar la Vmax y la constante de Michaelis-Menten (Km). Los “Optimal Designs” mostraron que en buffer acetato el tratamiento AB T2 fue el mejor, mientras que en buffer citrato fue el tratamiento CB T2. La comparación de medias entre todos los tratamientos mostró que CB T2 fue el mejor con 5291.665 ± 83.8 UL-1 UL-1 de actividad lacasa. La cinética enzimática llevada a cabo en las condiciones de CB T2 arrojó una Km de 0.0372 mM (aparente) y una Vmax de 0.0105 mM min-1 (aparente); indicando que las nuevas condiciones de ensayo aumentaban la afinidad de la rPOXA 1B por el ABTS (ácido 2,2'–azino–bis–(3–etillbenzotiazolin–6–sulfónico) en comparación con los parámetros cinéticos aparentes previamente reportados por nuestro propio grupo en buffer acetato.