Terapia génica basada en CRISPR/nCas9 para la enfermedad de Tay-Sachs : evaluación de vectores no virales

Abstract

La enfermedad de Tay-Sachs (TSD) es un trastorno neurodegenerativo causado por la deficiencia de la enzima β-hexosaminidasa A, lo que conduce a la acumulación de gangliósidos parcialmente degradados, principalmente en las células nerviosas y la médula espinal. Este trastorno devastador requiere nuevas estrategias terapéuticas como la terapia génica. Los vectores virales tradicionales pueden desencadenar respuestas inmunitarias, afectando negativamente la eficacia de la terapia génica debido a la neutralización de anticuerpos y la inhibición de la expresión genética. Por lo tanto, se han buscado alternativas no virales. En este proyecto se investigó el uso de CRISPR/nCas9 como herramienta genómica para la terapia génica de TSD en modelos celulares, utilizando el polímero PP6D5 como vector no viral.

Para evaluar la eficiencia del polímero PP6D5 en comparación con la lipofectamina 3000, se realizaron experimentos en tres modelos celulares: fibroblastos 3T3, astrocitoma U87MG y neuroblastoma SHSY5Y. Se analizó la citotoxicidad, la eficiencia de transfección y la actividad enzimática a corto y mediano plazo, utilizando tres plásmidos: donantes dHEXA y dHEXB, y CRISPR-nCas9. Se confirmó la edición on-target mediante ensayo con endonucleasas T7 e inserción donante (dHEXA) en células HEK293. Posteriormente, se repitió el mismo procedimiento para un modelo afectado por la enfermedad (fibroblastos de paciente TSD, GM00515). Finalmente, se evaluaron parámetros celulares, incluyendo la medición de masa lisosomal, especies reactivas de oxígeno, lípidos y autofagia de las células afectadas por la enfermedad, posterior a la terapia.

La transfección con el polímero PP6D5 demostró una menor citotoxicidad en el fibroblasto 3T3 (70,5 µM) en comparación con los otros modelos y una eficacia de transfección significativamente superior en todos los modelos celulares, registrando un 16,06% (3T3), 28,05% (U87MG) y 32,85% (SHSY5Y) frente a la lipofectamina 3000. En cuanto a la actividad enzimática, se observaron variaciones en los diferentes modelos celulares y en distintos momentos posteriores a la transfección. Para el modelo de fibroblastos GM00515, el polímero tuvo un IC50 de 33,49 µM con una eficiencia de transfección del 8,1%, superior a la de la lipofectamina (6,6%). La actividad enzimática con el polímero aumentó de 0 a 4,3% con dHEXA y a 6,2% usando los donantes dHEXA/dHEXB simultáneamente después de 15 días. La actividad se estabilizó hasta 30 días, pero disminuyó a 3,2% para dHEXA y 2,9% para dHEXA/dHEXB, mientras que las células transfectadas con lipofectamina 3000 mostraron un aumento adicional de 2,8% y 11,2% a los 15 y 30 días post-transfección, en comparación con células no tratadas. Sin embargo, estos niveles no alcanzaron los observados en fibroblastos sanos. Finalmente, se observó una disminución en la masa lisosomal y especies reactivas de oxígeno, y un aumento en lípidos polares y neutros en comparación con células no tratadas cuando fueron transfectadas con el polímero.

En conclusión, este estudio proporciona información fundamental para el tratamiento de TSD y otros errores innatos del metabolismo utilizando CRISPR/nCas9. Los resultados destacan el potencial de los vectores no virales, como el polímero PP6D5, y la expresión de HexA en modelos celulares relevantes para la enfermedad. Aunque no se observó una clara diferencia en la actividad enzimática entre la lipofectamina 3000 y el polímero PP6D5, este último mostró una eficiencia de transfección significativamente mayor que la lipofectamina 3000. Estos hallazgos establecen las bases para futuras investigaciones en modelos animales y para la corrección de anomalías genéticas en el sistema nervioso central.