Expresión de manganeso peroxidasa en Pichia pastoris X-33 bajo el control del promotor constitutivo GAP

Achury Camargo, Nixon Johan

Expresión de manganeso peroxidasa en Pichia pastoris X-33 bajo el control del promotor constitutivo GAP

dc.contributor.advisor	Rivera Hoyos, Claudia Marcela
dc.contributor.advisor	Poutou Piñales, Raúl Alberto
dc.contributor.author	Achury Camargo, Nixon Johan
dc.contributor.corporatename	Pontificia Universidad Javeriana
dc.contributor.evaluator	Montaña Lara, Jose Salvador
dc.date.accessioned	2020-12-15T13:39:28Z
dc.date.available	2020-12-15T13:39:28Z
dc.date.created	2020-12-04
dc.description.abstract	El incremento en la contaminación debido al vertimiento de sustancias tóxicas en diferentes cuerpos de agua causado por la industria ha incrementado la preocupación mundial, ya que estos vertimientos representan un riesgo para los ecosistemas, los animales y los humanos, siendo prioridad la búsqueda de soluciones y alternativas. En busca de soluciones se ha recurrido a los sistemas biológicos basados en el uso de microorganismos productores de enzimas con capacidad para degradar una gran variedad de compuestos, entre estos organismos están los hongos de podredumbre blanca que producen enzimas ligninolíticas como la manganeso peroxidasa. Debido a su lento crecimiento y a las condiciones específicas para producirlas se recurre a sistemas de producción heteróloga como Pichia pastoris. En este estudio se realizó la expresión de la enzima recombinante manganeso peroxidasa (E.C. 1.11.1.13) de P. chrysosporium en Pichia pastoris, bajo el control del promotor constitutivo GAP (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa). Para esto se optimizó la secuencia del gen codificante modificando el uso de codones mejorando cambiando el Índice de adaptación de codones (CAI) de 0,54 a 0,97 y se disminuyó el contenido GC a un 40,11% para lograr su expresión en P. pastoris. El gen sintético fue subclonado en pUC57 y transformado en E. coli (JM109) para aumentar la concentración del plásmido recombinante, extraer el gen y clonarlo en el vector de expresión pGAPZαA. El cual más adelante será integrado en el genoma de Pichia pastoris utilizando la técnica de electroporación. Con los clones recombinantes seleccionados se realizarán cinéticas de crecimiento en las que se medirán: actividad enzimática, fuente de carbono residual y se calcularon parámetros cinéticos (velocidad específica de crecimiento, tiempo de duplicación, rendimiento biomasa/sustrato y productividad). Adicionalmente, se realizó una revisión de literatura con respecto a la producción de diferentes proteínas heterólogas en sistemas inducibles y constitutivos especialmente empleando pAOX1 y pGAP y para la expresión de MnPH4. Dicha revisión permitió concluir que usar el promotor GAP puede implicar mayores beneficios, por ejemplo, al no usar metanol como inductor de la expresión, así como más facilidades en su uso, ya que, al ser un promotor constitutivo, que permite la trascripción de manera constante, es posible obtener mejores resultados con respecto a la producción y eficiencia de estas enzimas.	spa
dc.description.abstractenglish	The increase in pollution due to the dumping of toxic substances in different bodies of water caused by the industry has increased global concern, since these dumps represent a risk for ecosystems, animals and humans, being a priority the search for solutions and alternatives. In search of solutions, biological systems based on the use of enzyme-producing microorganisms with the ability to degrade a wide variety of compounds have been resorted to, among these organisms are white rot fungi that produce ligninolytic enzymes such as manganese peroxidase. Due to their slow growth and the specific conditions to produce them, heterologous production systems such as Pichia pastoris are used. In this study, the expression of the recombinant enzyme manganese peroxidase (E.C. 1.11.1.13) of P. chrysosporium in Pichia pastoris was carried out, under the control of the constitutive promoter GAP (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). For this, the coding gene sequence was optimized by modifying the use of codons, improving by changing the Codon Adaptation Index (CAI) from 0.54 to 0.97 and the GC content was decreased to 40.11% to achieve its expression in P. pastoris. The synthetic gene was subcloned into pUC57 and transformed into E. coli (JM109) to increase the concentration of the recombinant plasmid, extract the gene and clone it into the expression vector pGAPZαA. Which later will be integrated into the genome of Pichia pastoris using the electroporation technique. With the selected recombinant clones, growth kinetics will be carried out in 9 which the following will be measured: enzymatic activity, residual carbon source and kinetic parameters (specific growth rate, doubling time, biomass / substrate yield and productivity) were calculated. Furthermore, a literature review was carried out regarding the production of different heterologous proteins in inducible and constitutive systems especially using pAOX1 and pGAP and for the expression of MnPH4. This review allowed to conclude that using the GAP promoter may imply greater benefits, for example, by not using methanol as an inducer of expression, as well as more facilities in its expression, since, by having a constitutive promoter, which allows transcription in a constant way, it is possible to obtain better results regarding the production and efficiency of these enzymes.	spa
dc.description.degreelevel	Pregrado	spa
dc.description.degreename	Microbiólogo (a) Industrial	spa
dc.format	PDF	spa
dc.format.mimetype	application/pdf	spa
dc.identifier.instname	instname:Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.identifier.reponame	reponame:Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.identifier.repourl	repourl:https://repository.javeriana.edu.co	spa
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10554/52049
dc.language.iso	spa	spa
dc.publisher	Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.publisher.faculty	Facultad de Ciencias	spa
dc.publisher.program	Microbiología Industrial	spa
dc.rights.accessrights	info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.coar	http://purl.org/coar/access_right/c_abf2	spa
dc.rights.licence	Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional	*
dc.rights.local	De acuerdo con la naturaleza del uso concedido, la presente licencia parcial se otorga a título gratuito por el máximo tiempo legal colombiano, con el propósito de que en dicho lapso mi (nuestra) obra sea explotada en las condiciones aquí estipuladas y para los fines indicados, respetando siempre la titularidad de los derechos patrimoniales y morales correspondientes, de acuerdo con los usos honrados, de manera proporcional y justificada a la finalidad perseguida, sin ánimo de lucro ni de comercialización. De manera complementaria, garantizo (garantizamos) en mi (nuestra) calidad de estudiante (s) y por ende autor (es) exclusivo (s), que la Tesis o Trabajo de Grado en cuestión, es producto de mi (nuestra) plena autoría, de mi (nuestro) esfuerzo personal intelectual, como consecuencia de mi (nuestra) creación original particular y, por tanto, soy (somos) el (los) único (s) titular (es) de la misma. Además, aseguro (aseguramos) que no contiene citas, ni transcripciones de otras obras protegidas, por fuera de los límites autorizados por la ley, según los usos honrados, y en proporción a los fines previstos; ni tampoco contempla declaraciones difamatorias contra terceros; respetando el derecho a la imagen, intimidad, buen nombre y demás derechos constitucionales. Adicionalmente, manifiesto (manifestamos) que no se incluyeron expresiones contrarias al orden público ni a las buenas costumbres. En consecuencia, la responsabilidad directa en la elaboración, presentación, investigación y, en general, contenidos de la Tesis o Trabajo de Grado es de mí (nuestro) competencia exclusiva, eximiendo de toda responsabilidad a la Pontifica Universidad Javeriana por tales aspectos. Sin perjuicio de los usos y atribuciones otorgadas en virtud de este documento, continuaré (continuaremos) conservando los correspondientes derechos patrimoniales sin modificación o restricción alguna, puesto que, de acuerdo con la legislación colombiana aplicable, el presente es un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la enajenación de los derechos patrimoniales derivados del régimen del Derecho de Autor. De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, "Los derechos morales sobre el trabajo son propiedad de los autores", los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. En consecuencia, la Pontificia Universidad Javeriana está en la obligación de RESPETARLOS Y HACERLOS RESPETAR, para lo cual tomará las medidas correspondientes para garantizar su observancia.	spa
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/	*
dc.subject	Gen recombinante	spa
dc.subject	Manganeso peroxidasa	spa
dc.subject	pGAPZαA	spa
dc.subject	Pichia pastoris	spa
dc.subject	Proteínas heterólogas	spa
dc.subject.armarc	Microbiología industrial - Tesis y disertaciones académicas	spa
dc.subject.armarc	Proteínas recombinantes	spa
dc.subject.armarc	Enzimas - Investigaciones	spa
dc.subject.keyword	Recombinant gene	spa
dc.subject.keyword	Manganese peroxidase	spa
dc.subject.keyword	pGAPZαA	spa
dc.subject.keyword	Pichia pastoris	spa
dc.subject.keyword	Heterologous proteins	spa
dc.title	Expresión de manganeso peroxidasa en Pichia pastoris X-33 bajo el control del promotor constitutivo GAP	spa
dc.title.english	Manganese peroxidase expression in Pichia pastoris X-33 under the control of the constitutive GAP promoter	spa
dc.type.coar	http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f	spa
dc.type.driver	info:eu-repo/semantics/bachelorThesis
dc.type.hasversion	http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa
dc.type.local	Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado	spa