Comparación de la capacidad de unión in vitro de la proteína RBD SARS-Co V-2 producida en Komagataella phaffii y células HEK con el receptor hACE2

Gamba Díaz, Juan Camilo

Comparación de la capacidad de unión in vitro de la proteína RBD SARS-Co V-2 producida en Komagataella phaffii y células HEK con el receptor hACE2

dc.contributor.advisor	Espejo Mojica, Angela Johana
dc.contributor.advisor	Almeciga Diaz, Carlos Javier
dc.contributor.author	Gamba Díaz, Juan Camilo	spa
dc.contributor.evaluator	Castillo Ramirez, Jorge Andres	spa
dc.date.accessioned	2025-07-30T20:16:07Z
dc.date.available	2025-07-30T20:16:07Z
dc.date.created	2023-12-11	spa
dc.description.abstract	El SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) es el virus causante de la enfermedad COVID-19 (Coronavirus Disease – 2019). Para darse la infección, la espícula del virus, específicamente el dominio de unión al receptor (RBD), debe interactuar con el receptor de la Enzima Convertidora de Angiotensina 2 humana (hACE2), de manera que esta interacción ha sido uno de los objetivos principales para el desarrollo de terapias antivirales. Una de las pruebas que podría ser utilizada para evaluar el potencial terapéutico de este tipo de antivirales son los ensayos de neutralización. Estos ensayos utilizan generalmente líneas celulares y el virus activo, pero, dada la complejidad en la manipulación del virus, alternativamente se han utilizado proteínas reporteras. El objetivo de este estudio fue comparar la capacidad de unión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) con dos variantes (mutantes) de la proteína reportera RFP-RBD (Red Fluorescent Protein-Receptor Binding Domain) de SARS-CoV-2 producidas de forma recombinante en la levadura Komagataella. phaffii, y con la proteína RBD (wild type) producida en células HEK. De esta manera se realizó la transformación, tamizaje y producción mediante cultivos inducidos con metanol de las proteínas RFP-RBD/N501Y y RFP-RBD/N501Y+E484K en clones transformados de K. phaffii NRLLY-11430, así como la transfección y producción constitutiva de la proteína RBD/Wild Type en células HEK293FT. Se realizó seguimiento de la producción mediante Dot Blot y la purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad con el uso de una columna HisTrap™ FF y una triple diálisis posterior a esto. Una vez purificadas, se evidenció la actividad fluorescente de ambas variantes, siendo de ~50000 unidades sin diferencias significativas entre ambas variantes de RFP-RBD. Por último, su capacidad de unión al receptor ACE2 se evaluó mediante un ensayo de ThermalShift, el cual mostró un cambio en los Tm de la proteína ACE2 sugestivo de la interacción con los RBD, siendo este cambio mayor para las RBD con mutaciones con respecto a la variante de Wuhan proteínas (RFP-RBD/N501Y y RFP-RBD/N501Y+E484K).	spa
dc.description.abstractenglish	SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) is the virus responsible for the COVID-19 disease (Coronavirus Disease – 2019). For infection to occur, the virus spike, specifically the receptor-binding domain (RBD), must interact with the human Angiotensin-Converting Enzyme 2 (hACE2) receptor. Consequently, this interaction has been one of the main targets for the development of antiviral therapies. One of the tests that could be used to evaluate the therapeutic potential of these types of antivirals are neutralization assays. These assays generally use cell lines and active virus, but given the complexity of handling the virus, reporter proteins have alternatively been used. The objective of this study was to compare the binding capacity of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) with two variants (mutants) of the SARS-CoV-2 reporter protein RFP-RBD (Red Fluorescent Protein-Receptor Binding Domain) produced recombinantly in the yeast Komagataella phaffii and with the RBD (wild type) protein produced in HEK cells. To achieve this, the transformation, screening, and production were performed using methanol-induced cultures of RFP-RBD/N501Y and RFP-RBD/N501Y+E484K proteins in transformed clones of K. phaffii NRLLY-11430, as well as the transfection and constitutive production of the RBD/Wild Type protein in HEK293FT cells. Production was monitored using Dot Blot, and purification was performed using affinity chromatography with a HisTrap™ FF column and triple dialysis afterward. Once purified, the fluorescent activity of both variants was evidenced, being ~50000 units without significant differences between both RFP-RBD variants. Finally, their binding capacity to the ACE2 receptor was evaluated through a ThermalShift assay, which showed a change in the Tm of the ACE2 protein suggestive of interaction with the RBDs, with this change being greater for the mutated RBD proteins compared to the Wuhan variant (RFP-RBD/N501Y and RFP-RBD/N501Y+E484K).	spa
dc.description.degreelevel	Pregrado
dc.description.degreename	Microbiólogo (a) Industrial
dc.format	PDF
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.identifier.instname	instname:Pontificia Universidad Javeriana
dc.identifier.reponame	reponame:Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javeriana
dc.identifier.repourl	repourl:https://repository.javeriana.edu.co
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10554/70712
dc.language.iso	spa
dc.publisher	Pontificia Universidad Javeriana
dc.publisher.faculty	Facultad de Ciencias
dc.publisher.program	Microbiología Industrial
dc.rights.accessrights	info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.coar	info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.licence	Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional
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dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject	SARS-CoV-2
dc.subject	RBD (Dominio de Unión al Receptor)
dc.subject	Proteínas reporteras
dc.subject	Proteínas recombinantes
dc.subject	Capacidad de unión
dc.subject.armarc	Microbiología industrial - Tesis y disertaciones académicas
dc.subject.armarc	SARS-CoV-2	spa
dc.subject.armarc	Proteínas	spa
dc.subject.armarc	Hongos de la levadura	spa
dc.subject.keyword	SARS-CoV-2
dc.subject.keyword	RBD (Receptor Binding Domain)
dc.subject.keyword	Reporter proteins
dc.subject.keyword	Recombinant proteins
dc.subject.keyword	Binding capacity
dc.title	Comparación de la capacidad de unión in vitro de la proteína RBD SARS-Co V-2 producida en Komagataella phaffii y células HEK con el receptor hACE2	spa
dc.title.english	Comparison of the in vitro binding capacity of SARS-CoV-2 RBD protein produced in Komagataella phaffii and HEK cells with the hACE2 receptor	spa
dc.type.coar	http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f
dc.type.driver	info:eu-repo/semantics/bachelorThesis
dc.type.hasversion	http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa
dc.type.local	Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado