Terapia génica basada en CRISPR/nCas9 para la enfermedad de Tay-Sachs : evaluación de vectores no virales

Guerrero Vargas, Jacky Michelle

Terapia génica basada en CRISPR/nCas9 para la enfermedad de Tay-Sachs : evaluación de vectores no virales

dc.contributor.advisor	Alméciga Diaz, Carlos Javier
dc.contributor.author	Guerrero Vargas, Jacky Michelle
dc.coverage.temporal	2022-2024	spa
dc.date.accessioned	2024-08-09T15:28:50Z
dc.date.available	2024-08-09T15:28:50Z
dc.date.created	2024-07-23
dc.description.abstract	La enfermedad de Tay-Sachs (TSD) es un trastorno neurodegenerativo causado por la deficiencia de la enzima β-hexosaminidasa A, lo que conduce a la acumulación de gangliósidos parcialmente degradados, principalmente en las células nerviosas y la médula espinal. Este trastorno devastador requiere nuevas estrategias terapéuticas como la terapia génica. Los vectores virales tradicionales pueden desencadenar respuestas inmunitarias, afectando negativamente la eficacia de la terapia génica debido a la neutralización de anticuerpos y la inhibición de la expresión genética. Por lo tanto, se han buscado alternativas no virales. En este proyecto se investigó el uso de CRISPR/nCas9 como herramienta genómica para la terapia génica de TSD en modelos celulares, utilizando el polímero PP6D5 como vector no viral. Para evaluar la eficiencia del polímero PP6D5 en comparación con la lipofectamina 3000, se realizaron experimentos en tres modelos celulares: fibroblastos 3T3, astrocitoma U87MG y neuroblastoma SHSY5Y. Se analizó la citotoxicidad, la eficiencia de transfección y la actividad enzimática a corto y mediano plazo, utilizando tres plásmidos: donantes dHEXA y dHEXB, y CRISPR-nCas9. Se confirmó la edición on-target mediante ensayo con endonucleasas T7 e inserción donante (dHEXA) en células HEK293. Posteriormente, se repitió el mismo procedimiento para un modelo afectado por la enfermedad (fibroblastos de paciente TSD, GM00515). Finalmente, se evaluaron parámetros celulares, incluyendo la medición de masa lisosomal, especies reactivas de oxígeno, lípidos y autofagia de las células afectadas por la enfermedad, posterior a la terapia. La transfección con el polímero PP6D5 demostró una menor citotoxicidad en el fibroblasto 3T3 (70,5 µM) en comparación con los otros modelos y una eficacia de transfección significativamente superior en todos los modelos celulares, registrando un 16,06% (3T3), 28,05% (U87MG) y 32,85% (SHSY5Y) frente a la lipofectamina 3000. En cuanto a la actividad enzimática, se observaron variaciones en los diferentes modelos celulares y en distintos momentos posteriores a la transfección. Para el modelo de fibroblastos GM00515, el polímero tuvo un IC50 de 33,49 µM con una eficiencia de transfección del 8,1%, superior a la de la lipofectamina (6,6%). La actividad enzimática con el polímero aumentó de 0 a 4,3% con dHEXA y a 6,2% usando los donantes dHEXA/dHEXB simultáneamente después de 15 días. La actividad se estabilizó hasta 30 días, pero disminuyó a 3,2% para dHEXA y 2,9% para dHEXA/dHEXB, mientras que las células transfectadas con lipofectamina 3000 mostraron un aumento adicional de 2,8% y 11,2% a los 15 y 30 días post-transfección, en comparación con células no tratadas. Sin embargo, estos niveles no alcanzaron los observados en fibroblastos sanos. Finalmente, se observó una disminución en la masa lisosomal y especies reactivas de oxígeno, y un aumento en lípidos polares y neutros en comparación con células no tratadas cuando fueron transfectadas con el polímero. En conclusión, este estudio proporciona información fundamental para el tratamiento de TSD y otros errores innatos del metabolismo utilizando CRISPR/nCas9. Los resultados destacan el potencial de los vectores no virales, como el polímero PP6D5, y la expresión de HexA en modelos celulares relevantes para la enfermedad. Aunque no se observó una clara diferencia en la actividad enzimática entre la lipofectamina 3000 y el polímero PP6D5, este último mostró una eficiencia de transfección significativamente mayor que la lipofectamina 3000. Estos hallazgos establecen las bases para futuras investigaciones en modelos animales y para la corrección de anomalías genéticas en el sistema nervioso central.	spa
dc.description.abstractenglish	Tay-Sachs disease (TSD) is a neurodegenerative disorder caused by a deficiency of the enzyme β-hexosaminidase A that leads to the accumulation of partially degraded gangliosides, primarily in nerve cells and the spinal cord. This devastating disease requires new therapeutic strategies such as gene therapy. Traditional viral vectors can induce immune responses that negatively affect the efficacy of gene therapy by neutralizing antibodies and inhibiting gene expression. Therefore, non-viral vectors have been sought. In this project was investigated the use of CRISPR/nCas9 as a genomic tool for TSD gene therapy by using in vitro models and the PP6D5 polymer as a non-viral vector. To evaluate the efficiency of the PP6D5 polymer compared to lipofectamine 3000, experiments were performed in three cell models: 3T3 fibroblasts, U87MG astrocytoma, and SHSY5Y neuroblastoma. Cytotoxicity, transfection efficiency and short- and medium-term enzymatic activity were analyzed using three plasmids: dHEXA, dHEXB and CRISPR-nCas9. On-target editing was confirmed by T7 endonuclease assay and donor insertion (dHEXA) in HEK293 cells. The same procedure was then repeated in a diseased model (human TSD fibroblasts GM00515). Finally, cellular parameters including measurement of lysosomal mass, reactive oxygen species, lipids and autophagy of diseased cells were evaluated after therapy. Transfection with PP6D5 polymer showed lower cytotoxicity in 3T3 fibroblasts (70.5 µM) compared to the other models and significantly higher transfection efficiency in all cell models, registering 16.06% (3T3), 28.05% (U87MG) and 32.85% (SHSY5Y) compared to lipofectamine 3000. Variations in enzyme activity were observed in the different cell models and at different times after transfection. In the fibroblasts GM00515 model, the polymer had an IC50 of 33.49 µM with a transfection efficiency of 8.1%, higher than that lipofectamine (6.6%). Enzyme activity with the polymer increased from 0 to 4.3% with dHEXA and to 6.2% using dHEXA/dHEXB simultaneously within 15 days. Activity stabilized up to 30 days but decreased to 3.2% for dHEXA and 2.9% for dHEXA/dHEXB, while cells transfected with lipofectamine 3000 showed a further increase of 2.8% and 11.2% at 15 to 30 days post-transfection compared to untreated cells. However, these levels did not reach wild-type levels. Finally, there was a decrease in lysosomal mass and reactive oxygen species, and an increase in polar and neutral lipids compared to untreated cells when they were transfected with the polymer. In conclusion, this study provides fundamental information for the treatment of TSD and other inborn errors of metabolism using CRISPR/nCas9. The results highlight the potential of non-viral vectors, such as the PP6D5 polymer, and HexA expression in relevant cell models. Although no clear difference in enzymatic activity was observed between lipofectamine 3000 and PP6D5 polymer, the polymer showed significantly higher transfection efficiency than lipofectamine 3000. These findings lay the grounwork for future research in animal models and for the correction of genetic abnormalities in the central nervous system.	spa
dc.description.degreelevel	Maestría	spa
dc.description.degreename	Magíster en Ciencias Biológicas	spa
dc.format	PDF	spa
dc.format.mimetype	application/pdf	spa
dc.identifier.instname	instname:Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.identifier.reponame	reponame:Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.identifier.repourl	repourl:https://repository.javeriana.edu.co	spa
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10554/68334
dc.language.iso	spa	spa
dc.publisher	Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.publisher.faculty	Facultad de Ciencias	spa
dc.publisher.program	Maestría en Ciencias Biológicas	spa
dc.rights.accessrights	info:eu-repo/semantics/openAccess	spa
dc.rights.coar	http://purl.org/coar/access_right/c_abf2	spa
dc.rights.licence	Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional	*
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dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/	*
dc.subject	Enfermedad de Tay-Sachs	spa
dc.subject	Terapia génica	spa
dc.subject	CRISPR/nCas9	spa
dc.subject	Vectores no virales	spa
dc.subject	β hexosaminidasa A	spa
dc.subject	Polímero PP6D5	spa
dc.subject.armarc	Maestría en ciencias biológicas - Tesis y disertaciones académicas	spa
dc.subject.armarc	Terapia de gen	spa
dc.subject.armarc	Enfermedad de Tay-Sachs	spa
dc.subject.armarc	Proteína 9 Asociada a CRISPR	spa
dc.subject.keyword	Tay-Sachs disease	spa
dc.subject.keyword	Gene therapy	spa
dc.subject.keyword	CRISPR/nCas9	spa
dc.subject.keyword	Non-viral vectors	spa
dc.subject.keyword	β hexosaminidase A	spa
dc.subject.keyword	PP6D5 polymer	spa
dc.title	Terapia génica basada en CRISPR/nCas9 para la enfermedad de Tay-Sachs : evaluación de vectores no virales	spa
dc.title.english	CRISPR/nCas9-based gene therapy for Tay-Sachs disease. Tay-Sachs disease : evaluation of non-viral vectors	spa
dc.type.coar	http://purl.org/coar/resource_type/c_bdcc
dc.type.driver	info:eu-repo/semantics/masterThesis
dc.type.hasversion	http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa
dc.type.local	Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Maestría	spa