Caracterización de un banco de cepas de levaduras nativas para la  identificación de un nuevo sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes

Duque Díaz, Ivonne Melissa; Osorio Vargas, Erika Lorena

Caracterización de un banco de cepas de levaduras nativas para la identificación de un nuevo sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes

dc.contributor.advisor	Almeciga Diaz, Carlos Javier
dc.contributor.advisor	Rodriguez Lopez, Edwin Alexander
dc.contributor.author	Duque Díaz, Ivonne Melissa
dc.contributor.author	Osorio Vargas, Erika Lorena
dc.date.accessioned	2021-10-07T18:31:32Z
dc.date.available	2021-10-07T18:31:32Z
dc.date.created	2015
dc.description.abstract	Las levaduras son microorganismos ampliamente utilizados en la producción de proteínas recombinantes debido a las ventajas que presenta este sistema. Sin embargo, es importante identificar nuevos sistemas de expresión que permitan obtener mayores rendimientos y/o proteínas con mejores propiedades de estabilidad o actividad. El presente trabajo tuvo como fin caracterizar un banco de cepas nativas e identificar un nuevo sistema de expresión de proteínas recombinantes. Para la identificación de las levaduras se utilizaron métodos convencionales y moleculares. API 20C Aux mostró porcentajes de identificación con porcentajes entre el 81-99% y el MALDI-TOF de 1.86 – 2.17. Mediante los resultados obtenidos se seleccionaron dos levaduras para la producción de proteínas heterólogas: S. cerevisiae y W. anomalus; igualmente su cinética de crecimiento en fuentes como: glucosa 2%, sacarosa 2%, metanol 0,5% o glicerol% mostraron mayores velocidades de crecimiento y menor tiempo de duplicación a diferencia de las demás cepas. En S. cerevisiae se presentó un µx de 0,27 h-1 en sacarosa, y en glicerol y metanol, se presentó un comportamiento similar con un valor de 0,1 h-1 . W. anomalus presentó un µx de 0,3 h-1 tanto en glucosa como sacarosa y de 0,1 h-1 en metanol y glicerol. Posteriormente se realizó una confirmación para la identificación de W. anomalus mediante la amplificación de un fragmento del ITS, los resultados permitieron confirmar los resultados obtenidos para esta cepa empleando MALDI-TOF y API. Finalmente, estos microorganismos se transformaron con plásmidos conteniendo los genes de las enzimas celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91) o β- glucosidasa (E.C.3.2.1.21), se observó que independiente del método utilizado para la transformación con S. cerevisae no se obtuvieron colonias transformantes, sin embargo con W. anomalus se obtuvieron clones de ambos plásmidos. Con el fin de evaluar la expresión de la enzima se realizaron cultivos a pequeña escala observando que la levadura nativa W. anomalus produce la enzima β- glucosidasa de forma endógena por lo que los clones evaluados fueron descartados debido a que la expresión de estos no superaron a los valores del blanco; por otro lado se observó actividad celobiohidrolasa de 5.65 U/L a la hora 96 de cultivo en uno de los clones, lo cual se contrasta con trabajos previos con otras levaduras en los que no se ha observado actividad para esta enzima recombinante. En el presente estudio se demostró que los tres métodos de identificación permitieron la edificación de una nueva cepa y se muestra por primera vez el uso de la levadura W. anomalus como sistema para la producción de proteínas recombinantes.	spa
dc.description.abstractenglish	Yeasts are widely used microorganisms for the production of recombinant proteins because of the advantages of this system. However, it is important to identify novel expression systems that enable higher yields and / or proteins with improved stability properties or activity. The present studies was aimed at characterizing a bank of native strains and identify a new system of expression of recombinant proteins. For the identification of yeasts and standard molecular methods they were used. API 20C Aux showed percentages identifying with percentages between 81-99% and MALDI-TOF of 1.86 - 2.17. The results obtained using two yeasts for production of heterologous proteins were selected: S. cerevisiae and W. anomalus; equally growth kinetics sources: 2% glucose, 2% sucrose, 0.5% methanol or glycerol% showed higher growth rates and doubling time less unlike the other strains. In S. cerevisiae one μx 0.27 h-1 sucrose was presented, and glycerol and methanol showed a similar pattern with a value of 0.1 h-1. W. anomalus presented a μx 0.3 h-1 in both glucose and sucrose and 0.1 h-1 in methanol and glycerol. Subsequently, a confirmation for identifying W. anomalus was performed by amplifying a fragment of the ITS, the results allowed to confirm the results obtained for this strain using MALDI-TOF and API. Finally, these microorganisms were transformed with plasmids containing genes of β- glucosidase (EC3.2.1.21) enzyme cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) or it was observed that independent of the method used for transforming S. cerevisiae with no colonies were obtained transformants, however W. anomalus clones with both plasmids were obtained. In order to evaluate the expression of the enzyme cultures were performed on a small scale noting that the native yeast produces W. anomalus β- glucosidase enzyme endogenously so the clones evaluated were discarded due to the expression of these not exceeded the blank values; Furthermore cellobiohydrolase activity of 5.65 U / L was observed at 96 hours of culture in one of the clones, which contrasts with previous work with other yeasts in which activity was not observed for the recombinant enzyme. In the present study it showed that the three methods of identification allowed the construction of a new strain and shown for the first time the use of the yeast W. anomalus as a system for the production of recombinant proteins.	spa
dc.description.degreelevel	Pregrado	spa
dc.description.degreename	Bacteriólogo (a)	spa
dc.format	PDF	spa
dc.format.mimetype	application/pdf	spa
dc.identifier.doi	https://doi.org/10.60794/gb9z-cn65
dc.identifier.instname	instname:Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.identifier.reponame	reponame:Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.identifier.repourl	repourl:https://repository.javeriana.edu.co	spa
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10554/57612
dc.language.iso	spa	spa
dc.publisher	Pontificia Universidad Javeriana	spa
dc.publisher.faculty	Facultad de Ciencias	spa
dc.publisher.program	Bacteriología	spa
dc.rights.accessrights	info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.coar	http://purl.org/coar/access_right/c_abf2	spa
dc.rights.licence	Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional	*
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dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/	*
dc.subject	Proteínas recombinantes	spa
dc.subject	Wickerhamomyces anomalus	spa
dc.subject	Sistemas de expresión	spa
dc.subject	Celobiohidrolasa	spa
dc.subject	Identificación	spa
dc.subject.armarc	Bacteriología - Tesis y disertaciones académicas	spa
dc.subject.armarc	Proteínas recombinantes	spa
dc.subject.armarc	Levaduras	spa
dc.subject.keyword	Recombinant proteins	spa
dc.subject.keyword	Wickerhamomyces anomalus	spa
dc.subject.keyword	Expression sistems	spa
dc.subject.keyword	Cellobiohydrolase	spa
dc.subject.keyword	Identification	spa
dc.title	Caracterización de un banco de cepas de levaduras nativas para la identificación de un nuevo sistema de expresión para la producción de proteínas recombinantes	spa
dc.title.english	Characterization of a bank of native yeast strains for the identification of a new expression system for the production of recombinant proteins	spa
dc.type.coar	http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f
dc.type.driver	info:eu-repo/semantics/bachelorThesis
dc.type.hasversion	http://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa
dc.type.local	Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado	spa